白喉棒状杆菌ATCC 11913的实验室培养方法

一、引言

白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）是引起人类白喉的病原体，其毒力与携带的β-噬菌体编码的外毒素基因（tox）相关。ATCC 11913是该菌的标准参考菌株，常用于微生物学研究和疫苗开发。本文介绍其常规实验室培养方法。

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二、材料准备

1. 培养基选择

   • 推荐培养基：

     • 吕氏血清斜面（Loeffler Serum Medium）：适合分离培养，促进异染颗粒形成。

     • 亚碲酸钾血琼脂（Tellurite Blood Agar, TBA）：选择性培养基，抑制杂菌生长，白喉杆菌菌落呈黑色或灰黑色。

     • 脑心浸液肉汤（BHI Broth）：用于液体增菌培养。

   • 培养基配制：
     按ATCC建议或商品化培养基说明书配制，高压灭菌后冷却至50°C（若含血液或血清需无菌添加）。

2. 菌种来源

   • ATCC 11913冻干粉或甘油保存菌种，需按生物安全二级（BSL-2）标准操作。

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三、培养步骤

1. 菌种活化

   • 冻干粉复苏：
     无菌条件下加入0.5 mL BHI肉汤溶解，取100 μL接种于吕氏血清斜面，37°C培养18-24小时。

   • 甘油菌种复苏：
     用接种环蘸取菌液划线接种于TBA平板，37°C培养24-48小时。

2. 扩大培养

   • 固体培养：挑取单菌落接种至新鲜TBA或吕氏斜面，37°C培养24小时。

   • 液体培养：将菌落接种至BHI肉汤中，37°C、180 rpm振荡培养16-20小时，至OD₆₀₀≈0.6。

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四、观察与鉴定

1. 菌落特征

   • TBA平板：菌落呈黑色或灰黑色，直径1-2 mm，中心凸起，边缘不规则。

   • 吕氏斜面：形成细小、灰白色菌苔，异染颗粒（Albert染色）明显。

2. 镜检

   • 革兰氏染色：阳性，菌体呈棒状、V形或栅栏状排列。

   • 亚甲蓝染色：异染颗粒（深蓝色颗粒）清晰可见。

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五、菌种保存

1. 短期保存：4°C斜面保存，每2周转接一次。

2. 长期保存：

   • 甘油冻存：菌液与40%甘油按1:1混合，-80°C保存。

   • 冷冻干燥：按ATCC标准流程制备冻干粉。

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六、注意事项

1. 生物安全：

   • 实验需在BSL-2实验室进行，操作者佩戴手套、口罩及防护服。

   • 废弃物需121°C高压灭菌30分钟。

2. 质量控制：

   • 定期检测菌株纯度（如革兰氏染色、生化试验）。

   • 参考ATCC提供的菌株特性（如硝酸盐还原试验阳性、尿素酶阴性）。

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七、结语

通过上述方法可高效培养白喉棒状杆菌ATCC 11913，为其毒力研究、抗生素敏感性试验或疫苗研发提供实验基础。需严格遵守生物安全规范，避免实验室污染及人员感染。