细胞铺板实验主要步骤及注意事项

　　细胞铺板是细胞实验中必须掌握的一门技术，虽然看起来非常简单，但却难以掌握。

　　很多人经常会遇到细胞中间密或者中间稀疏等「细胞分布不均匀」的情况。如下图为：细胞铺板时，常出现的细胞分布不均匀现象。

　　细胞铺板时常出现的细胞分布不均匀现象

　　铺板成功的关键在于对细胞消化和铺板方法的正确拿捏和掌握。

　　（1）细胞一定要消化好；

　　（2）铺板前要混匀，把存在的细胞团尽可能分开。

　　细胞铺板实验

　　主要分为3大步骤：收集细胞→细胞计数→细胞铺板。

　　一、收集细胞，制作单细胞悬液

　　①吸弃培养皿中的原培养液，用1~2 ml的PBS洗两次

　　②弃去PBS，加入适量胰酶进行消化，显微镜下观察细胞皱缩、变圆，结束消化。（不同细胞消化时间差异较大）

　　③消化完全后，吸取细胞悬液离心（800 rpm*5 min），弃去上清液，加入适量培养基制得单细胞悬液（可能需要稀释，防止细胞数太多影响计数结果），进行细胞计数。

　　消化细胞需要选择适用的消化液、适当的消化温度和时间。建议新手或者养的是一个新细胞时，预实验观察最佳胰酶消化时间及浓度。

　　消化后需要轻轻拍打细胞贴壁面，震落细胞。

　　一般用1000rpm/min离心即可，离心力太大细胞容易抱团！

　　离心后，要充分悬浮。一般先加2mL液体后用1mL移液器轻轻将细胞吹起（注意不要有气泡），这样易于形成单细胞。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力，所以要熟练操作，尽快上板。

　　二、细胞计数

　　在显微镜下观察细胞计数板，分别记录1、2、3、4每个方格的细胞数目，计上不计下，计左不计右。四个方格的细胞总数记为X。因为每个方格的容积为0.1mm3，即0.1×10-3ml，可知细胞悬液密度C1=（X/4）/（0.1×10-3ml）=(X/4)×104个/ml。如果计数前进行了稀释且稀释倍数为M，则原细胞悬液密度为C2=(X/4)×M×104个/ml。确定细胞悬液密度后，再根据每个孔需添加的细胞数及孔数确定所需加液量。

　　三、细胞接种

　　需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率（IC50）测试时，通常使用96孔板，一方面可以设置浓度梯度；另外还可一次性测多个药物，减少实验误差。

　　①稀释细胞：根据细胞计数结果后，将细胞稀释到目的浓度。

　　细胞密度对于铺板很重要，过密很容易造成细胞居中，细胞浓度过稀会造成细胞难以生长起来。一般会在实验前进行预实验。

　　②加入细胞悬液

　　为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象，通常在每一个孔加少量的无血清培养基，不用太多，浸润孔底即可。一般可加一个孔，浸润，再用移液枪移取，再加入第二个孔，浸润，依此类推。

　　如果培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，可以多加点液体缓解。

　　然后加入细胞悬液，从孔的左边靠近底部贴壁慢慢加入，这样加液后，细胞悬液会平铺在整个孔底，细胞分散较均匀，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象。

　　十字摇匀法：

　　将板放在水平板面上“十字”形摇匀（上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次）。不可以转圈摇，会导致细胞被带到中间。

　　一般来说，“十字摇匀”对于12孔板，24孔板，96孔板中接种细胞时不怎么适用了。这个时候，我们可以通过轻拍使得细胞均匀分布。

　　轻拍摇匀法：

　　以12孔板为例，在接种细胞后，合上盖子，左手大拇指捏住12孔板中间（或者左下角）,保持水平，底和盖子始终紧紧合上。右手掌轻轻拍打右侧，注意力度，力道太大培养基会溅到盖子上，力度过小则难以使细胞混匀，以拍打时培养基来回晃动且不溅出为宜，拍打右侧10次左右。然后拍打前侧，10次左右。这个时候细胞基本铺匀了，我们可以在显微镜下观察，细胞悬液是否均匀分布。如果觉得通过细胞悬液不容易判断细胞是否均匀，可将12孔板放置于显微镜载物台，10分钟以后细胞基本沉降，这时再进行观察。如果发现不匀，就重复前面操作。

　　注意，12孔板有6个面，前，后，左，右，上，下。我们只需要拍打两个面，右侧和后侧。千万不要每个面都拍打！另外，拍打次数也可以根据实际情况相应调整，结合镜下观察情况，选择最适宜自己的方式。

　　摇匀后要放工作台静置一下，等细胞贴壁了，轻轻移入到培养箱中。

　　用排枪吸取时，一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致。

　　如果是用于进行MTS等长时间测试时，最外圈应空余出来（中间60孔为最佳，四周的一圈边缘孔不接细胞），加入PBS或细胞悬液（做空白或阴性对照），以防止培养基蒸发引起的边缘效应。

　　培养箱里面或者外面尽量不要放可以产生振动的仪器，比如蠕动泵、离心机、涡旋器一类的仪器。这些仪器产生的振动对细胞贴壁有影响，也可能会导致细胞贴壁不均匀。

　　其实细胞铺板不一定都需要单个单个的那么均匀。

　　免疫荧光时，就可以选择铺中间少，周围稍多的板子。

　　在提取蛋白或者提取RNA的时候有时会选择铺中间多，四周少的板子，因为有些细胞刮刀不好用，没有办法刮到周围的。

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