甘油冷冻保藏菌种的原理及注意事项

　　菌种保藏是将微生物菌种采用适宜的方法妥善保藏，避免其死亡、污染，并保持其原有性状基本稳定的一种实验方法，也是微生物实验室极为重要的一项基础性工作。

　　甘油冷冻保藏菌种是目前实验室应用最为广泛的一种的菌种保藏方法，原理是以甘油为保护剂，低温冷冻条件下，使微生物的新陈代谢趋于停止，从而达到长期有效的保藏。一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好，目前实验室大都采用-80℃（-70℃）冰箱保藏。主要有以下注意事项：

　　1、选择合适的培养基：勿使用选择性培养基。一般使用非选择性的增菌培养基，因为微生物在选择性培养基中生长某些生物特性可能丢失，保藏的菌种的生物特性可能与标准菌株特性不同。

　　2、菌液的浓度：菌液的浓度一般越大，菌种保存时间越长。保藏时细菌常使用菌液，霉菌常用无菌水或生理盐水制备成的孢子悬液。

　　3、甘油浓度：甘油终浓度一般为10%~20%。由于甘油原液太粘稠，需要配制合适的甘油-水溶液，将菌悬液与甘油以1:1的体积比充分混匀后，分装至提前灭菌好的保藏管中，-80℃（-70℃）冰箱保存。

　　4、反复使用：对菌种进行保藏时注意“慢冻快化”，冷冻时降温速率保持1℃/min,复苏时用37℃水浴融化，能够保证菌种最大的成活率。当冷冻菌种融化后，应避免再次冷冻，否则菌体的生存率会大幅度降低。

　　5、保存时间：该方法适合中长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。

　　6、核查验证：每半年进行一次菌种确认试验，通过平板划线分离、观察菌落形态、染色镜检等常规实验检测细菌的存活情况。若有条件，可用菌株生化鉴定试剂盒进行确认。

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