细胞消化不下来之最全解决方案

　　小伙伴们在给贴壁细胞传代的时候有没有遇到细胞消化不下来的情况呢？有时候等了10分钟甚至20分钟细胞仍岿然不动，继续等待怕消化过度，暴力吹下又怕对细胞造成机械损伤，可谓进退两难。

　　小编为大家总结了细胞难消化的原因，以及对应的处理方式：

　　（本文仅针对胰蛋白酶，若您使用其他类型的细胞解离试剂，可以在评论区留言）

　　细胞贴壁紧

　　不同种类的细胞贴壁的松紧程度是不一样的，比如293系列细胞贴壁很松，是晃一晃就可能掉下来的程度。而MCF10A细胞却贴壁很紧，可能需要消化5-10min甚至更久才能脱落。在培养一株细胞之前，可以问问有经验的师哥师姐或者上网查资料确认这株细胞大概消化多久，做到知己知彼百战百胜。

　　解决方案：若您培养的细胞贴壁较紧，可以增加消化时间或胰酶的浓度；加入足量的胰酶至没过细胞；37℃消化；使用含有EDTA的胰酶。

　　小技巧：

　　在消化贴壁较紧的细胞有个小技巧，就是消化到细胞要脱落的时候先不终止，先吸胰酶轻轻吹下细胞，大部分细胞脱落后再加终止液。贴壁太强的细胞，先加终止有时候会很快贴壁回去导致消化其实细胞已经要脱落了，但一加终止液就贴回去的情况。

　　有残留血清

　　血清中的某些蛋白质（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）对蛋白酶有强烈的抑制作用。如果PBS清洗不彻底，胰酶将不能发挥作用。

　　解决方案：若在消化途中发现因润洗不彻底而无法消化下来，吸去培养器皿中的胰酶（如果已有部分细胞脱落，将已脱落细胞转移至离心管），向培养器皿中加入足量PBS重新润洗30s，弃去PBS再加入新的胰酶重新消化。

　　胰酶量过少/浓度低/消化温度低

　　有的小伙伴习惯用胰酶润洗细胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶继续消化，这对于贴壁松的细胞是可以的，但该方法并不适用于贴壁紧的细胞。胰酶量太少无法将贴壁紧的细胞消化彻底。

　　胰酶的最适温度是37℃，有一种常用策略是室温消化，当温度低于37℃时胰酶活性低，室温环境消化还可以放在显微镜下边看边消化，更容易把握消化进度。但仍然需要注意这适用于贴壁较松且比较脆弱的细胞，对于贴壁紧的细胞室温下是很难消化下来的，甚至可能因消化时间过长对细胞产生伤害。

　　常见的胰酶浓度有0.125%，0.25%和0.5%。常规细胞系多用0.25%胰酶，而对胰酶敏感的较脆弱的细胞可使用0.125%胰酶消化。应根据细胞的贴壁特性和胰酶耐受程度，使用不同浓度的胰酶。

　　解决方案：根据细胞贴壁特性选择合适的胰酶使用量、浓度和消化温度。

　　胰酶失活

　　胰酶开封久了活性会降低甚至彻底失活，所以小伙伴们可以根据需要将开封的胰酶分装到离心管中，将暂时不用的部分放在-20℃冰箱冷冻，放在2-8℃冷藏的胰酶也要尽早使用完毕哦。

　　解决方案：若发现胰酶开封太久，建议使用新的胰酶进行消化。

　　胰酶品牌差异

　　胰酶通常来自牛或猪的胰腺，不同厂家的提取加工工艺不同，所生产的胰酶消化时间差别较大。

　　解决方案：从不同厂家获取胰酶试用装，找到最适合自己细胞的胰酶品牌。

　　细胞密度过大或长时间不传代

　　细胞密度过大，造成细胞拥挤或者堆叠时细胞将变得更难消化。另外，细胞长时间培养不传代也有可能使细胞贴壁变紧。

　　解决方案：若出现上述情况，可增加胰酶的用量，并适当延长消化时间，直到细胞能够脱落。