CT26小鼠结肠癌细胞描述背景及应用

　　CT26细胞是被N-亚硝基-N-甲基脲烷（NNMU）诱导得到的未分化的小鼠结肠癌细胞，该细胞的一个克隆形成的细胞系被命名为CT26.WT。CT26.WT被逆转录病毒载体LXSN稳定转化形成了一个致死性的亚克隆CT26.CL25，这一病毒载体含有lacZ基因、编码肿瘤相关抗原（TAA）和beta半乳糖苷酶。CT26.WT和CT26.CL25细胞在小鼠中生长速度和致死率都很相似，不同的是CT26.CL25细胞可以表达肿瘤相关抗原和beta半乳糖苷酶，因此这两株细胞可以联合用于免疫治疗和宿主免疫反应的研究。

　　细胞特性

　　1）来源：小鼠结肠

　　2）形态：成纤维细胞样，贴壁生长

　　3）含量：>1x10^6细胞数

　　4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　5)用途：仅供科研使用。

　　运输和保存

　　干冰运输及复苏好存活细胞

　　（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

　　细胞接收后的处理

　　1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

　　2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

　　3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

　　4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。

　　一．培养基及培养冻存条件准备：

　　1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

　　2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

　　3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　二．细胞处理：

　　1）冻存细胞的复苏：

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

　　1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

　　3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

　　3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

　　小鼠结肠癌细胞可以用于胡桃醌对小鼠结肠癌CT-26体内抑制作用及机制研究

　　研究胡桃醌对结肠癌CT-26细胞在小鼠体内增殖、凋亡及转移的影响,以及胡桃醌促进CT-26肿瘤细胞凋亡和抑制其转移的相关可能作用机制。同时,探究了胡桃醌治疗结肠癌期间对荷瘤小鼠的机体免疫功能的影响。

　　选取健康的Balb/c小鼠皮下荷瘤,随机分为6组,分别为模型组(2%乙醇生理盐水溶液)、阳性对照组(20mg/kg 5-FU)、胡桃醌高剂量组(2.5mg/kg)、胡桃醌中剂量组(1.25mg/kg)、胡桃醌低剂量组(0.625mg/kg)、联合用药组(胡桃醌2.5mg/kg+5-FU20mg/kg),按体重每日腹腔注射给药一次,连续给药10天。末次给药结束24h后,称重记录并准备收集血液、胸腺、脾脏、肿瘤组织样本。血液静置离心分离得血清,应用Elisa方法检测ICAM-1、VEGF、GSH、IL-8在小鼠血清中的含量;胸腺和脾脏称重计算胸腺指数与脾脏指数;肿瘤组织测量长径与短径计算瘤体积,称重记录瘤重;将肿瘤组织切割为两部分,一部分置于生理盐水用于流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡,另一部分固定于4%甲醛溶液,用于HE染色病理观察以及免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、β-链蛋白的表达水平。

　　实验结果表明,胡桃醌高剂量2.5mg/kg和中剂量1.25mg/kg均可有效抑制结肠癌CT-26细胞在小鼠体内的生长,抑瘤率分别为46.2%和42.4%;胡桃醌与5-FU联合应用抑瘤率为74.8%,比胡桃醌与5-FU单独应用的抑瘤效果好;5-FU治疗肿瘤时,小鼠的胸腺指数、脾脏指数、体重与模型组相比均显著性下降,而胡桃醌治疗后,小鼠的胸腺指数、脾脏指数、体重均无显著性下降,胡桃醌可使CT-26肿瘤细胞阻滞于G2/M期,并下调肿瘤细胞中Bcl-2蛋白、β-链蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达,上调Bax与Caspase-3蛋白表达;胡桃醌高剂量2.5mg/kg可显著降低荷瘤小鼠血清中ICAM-1、VEGF和GSH的含量。

　　根据结果可知胡桃醌在抗肿瘤过程中,与5-FU相比可维持机体的体重和免疫功能;胡桃醌的抗肿瘤作用机制可能是阻滞CT-26肿瘤细胞周期于G2/M期影响其增殖,介导线粒体依赖的Caspase-3凋亡途径促进肿瘤细胞凋亡,下调血管生成因子、β-链蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白的表达抑制肿瘤细胞浸润与转移。本研究为胡桃醌成为可能的抗结肠癌药物提供新的理论和实验依据。