MH-S细胞系培养要点及应用

　　MH-S细胞系是通过SV40转化小鼠肺泡巨噬细胞的粘附细胞富集群体而衍生的。细胞保留了肺泡巨噬细胞的许多特性，包括典型的巨噬细胞形态。它们是粘附的，吞噬的，酯酶阳性的和过氧化物酶阴性的。脂多糖（LPS）处理可刺激IL-1的产生。所述细胞能够以细胞剂量依赖性方式抑制体外噬菌斑形成细胞（PFC）应答。

　　细胞特性

　　1）来源：7周龄小鼠肺

　　2）形态：悬浮和贴壁细胞混合生长

　　3）含量：>1x10^6细胞数

　　4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　5）用途：仅供科研使用。

　　运输和保存

　　干冰运输及复苏好存活细胞

　　（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

　　细胞接收后的处理

　　1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

　　2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

　　3）半贴细胞和贴壁不牢（悬浮）细胞：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在60%以下，客户需收集T25瓶中的悬浮细胞离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长70%-90%对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

　　4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。

　　细胞培养步骤

　　一．培养基及培养冻存条件准备

　　1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；0.05mMβ－巯基乙醇双抗1%。该细胞为悬浮和贴壁细胞混合生长。

　　2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　二．细胞处理

　　1）冻存细胞的复苏

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

　　该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

　　1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

　　3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

　　3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

　　下面T25瓶为例；

　　1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

　　2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

　　3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

　　用于重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞及其在烟曲霉感染中的作用研究

　　重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,构建Dectin-1高表达的细胞模型。

　　材料与方法：重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染MH-S细胞（Ad-Dectin-1-EGFP组）,荧光显微镜观察转染情况,MTT法检测细胞增殖情况,确定转染的感染复数（multiplicity of infection,MOI）值。Real-time PCR法检测Dectin-1基因mRNA表达量,Western blot检测Dectin-1蛋白表达量,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞膜表面Dectin-1表达情况。同时设不转染腺病毒的MH-S细胞为空白对照,转染空病毒的MH-S细胞为阴性对照（Ad-EGFP组）。

　　结果：重组腺病毒转染MH-S细胞12h即可见少量绿色荧光表达,48 h荧光强度达到峰值,MOI值为2200时细胞增值率下降,转染MOI值为1800。Real-timePCR和Western blot检测发现,Dectin-1基因mRNA和蛋白表达量均较Ad-EGFP组显著增加。

　　激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测进一步证实,细胞膜表面有Dectin-1表达,且表达量较Ad-EGFP组显著增加。

　　结论：重组腺病毒Ad-Dectin-1可在体外转染MH-S细胞,转染后Dectin-1基因mRNA和蛋白表达显著增加,Dectin-1高表达的细胞模型构建成功。