细胞冻存与复苏的超详细操作指南

　　细胞生物学研究中，为了让细胞能实现长期研究细胞生物学功能的效果，实验人员往往需要通过一些处理方式将良好状态的细胞保存起来，以备后期可以使用。

　　细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于后续实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

　　要想做好细胞冻存和复苏，需要牢记四个字：慢冻快融！

　　一、为什么要慢冻快融？

　　在冷冻保存时，细胞外环境中的水会结冰。冷却速度的不同会导致细胞由于渗透脱水而发生不同程度的收缩。细胞外环境的渗透压随着水结成冰晶而不断升高，冷却速度越慢，细胞内水分通过渗透作用移出细胞的时间就越长。因此，非常缓慢的冷却可能会导致细胞因过度脱水而死亡(A)。而快速冷却(C)会导致细胞内形成冰晶，这会导致细胞在复温时死亡。中间冷却速度(B)则可以平衡渗透脱水和细胞内结冰形成的风险，通常可以实现细胞存活率最大化。

　　如果在冻存液中加入保护剂(如DMSO)，可使冰点降低，增加细胞渗透压稳定性。减缓慢速降温过程中的脱水皱缩现象，在缓慢冻结时减少冰晶的生成，使细胞免受损伤。

　　在复苏时，需要快速升温，在1-2 min内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。

　　二、细胞冻存操作步骤及注意事项：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷。注：冻存液应于实验当天新鲜配制。常用的细胞冻存液配方为，培养基：血清：DMSO=7:2:1。②DMSO是最常用的冷冻保护剂，DMSO具有吸湿性，应将其储存于干燥环境中，避免使用开封1年以上的DMSO。③可以直接购买商品化的细胞冻存液。离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1000rpm，时间5min）。

　　注：细胞冻存的最佳时机：细胞处于对数生长期，状态良好，且实验结果良好，此时的细胞最适合冻存。最好在复苏两周内冻存细胞，留一部分细胞继续培养用于后续实验。

　　用配制好的冻存液重悬细胞，按照1mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记。注：①冻存的细胞浓度：建议细胞为1*106个/ml。更高的细胞浓度并不会提高解冻后的活细胞数量，反而会由于高浓度引起的堆积效应而影响细胞活力。②冻存液体积：常规2ml冻存管以1ml冻存体积为佳。不建议单个样本体积过大，否则会由于各部分冷却速度不一致而导致细胞活力受损。③标记和记录：在冻存管上标记清楚细胞名称、代数、冻存人、冻存时间，并在记录本上登记细胞信息以及详细的存放位置，以便在复苏的时候正确拿取细胞。④冻存管的盖子一定要拧紧，否则冻存过程中液氮渗入到冻存管中，取出后，液氮容易挥发，导致体积迅速膨胀，但是又不能及时的排出而引起爆炸，也易造成污染。

　　冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）。

　　注：降温速度：对于大多数细胞，-1℃/min的降温速度能够极大保存细胞活力。

　　可使用程序降温盒或梯度降温，推荐的梯度降温步骤为：4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜→液氮保存，亦可选择商品化的非程序性细胞冻存液，可直接存放至-80℃。

　　冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存。

　　注：储存条件：短期可储存-80℃，长期储存应保存在液氮中。长期存放于-80℃可能会降低细胞活力和功能。

　　三、细胞复苏操作步骤及注意事项：

　　水浴锅预热至37℃备用。

　　注：水浴锅的水要定期更换，至少2周一次，水中需加入抑菌剂。准备15mL离心管，并向其中加入适量培养基待用。注：离心管中加入1~4mL的培养基，比较难养的细胞，可适量增加培养基。将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅。

　　注：如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远（步行超过1min），要把细胞先置于干冰上，再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里，可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中，是为了预防污染。

　　用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化。

　　注：这一步越快融化越好，最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化，可能是冻存液量偏多，或者摇晃力度不够。

　　用纸巾擦拭水渍，酒精喷洒冻存管后，转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的15ml离心管。注：当同时复苏多管细胞时，注意不要弄混。1200rpm离心5分钟。注：离心是为了去除DMSO和细胞碎片。弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至新的无菌培养器皿中。储存条件：短期可储存-80℃，长期储存应保存在液氮中。长期存放于-80℃可能会降低细胞活力和功能。依据细胞状态，在细胞贴壁后或24 h后换液，继续培养。