简述实验室微生物培养步骤方法

　　微生物培养（microculture)是生物培养的中的一种。所培养的微生物主要有病毒、细菌、放线菌、真菌等。微生物培养需要用到培养基，根据微生物的不同种类和生活习性来配制特定的培养基。微生物培养成功的关键在于无菌操作，如果培养器具和培养基不能彻底灭菌、培养的过程中有杂菌污染是很容易失败的。那么微生物培养步骤有哪些呢？

　　实验室微生物培养步骤

　　实验材料

　　1培养基和菌种

　　淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基，活性污泥混合液。普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

　　2溶液或试剂

　　10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。

　　3仪器或其它用具

　　无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。

　　微生物培养步骤

　　1、流程

　　倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。

　　2、步骤

　　2.1稀释涂布平板法

　　2.1.1倒平板

　　将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

　　倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

　　2.1.2制备活性污泥混合液稀释液

　　称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的活性污泥混合液溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。

　　2.1.3涂布

　　将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6，从三管活性污泥混合液稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

　　2.1.4培养

　　将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

　　2.1.5观察并挑菌落

　　将培养后长出的单个菌落根据其大小、颜色、形状等特征进行观察，之后根据菌落不同特征分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

　　2.2平板划线分离法

　　2.2.1倒平板

　　按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。

　　2.2.2划线

　　在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的活性污泥混合液悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

　　用接种环以无菌操作挑取活性污泥混合液悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

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