质粒序列鉴别的必要性及当前痛点问题

　　背景介绍

　　质粒（Plasmid）是发现于细菌、真菌等生物中拟核或细胞核以外的闭合环状双链DNA分子，具有自主复制能力。游离质粒可以随着宿主基因组复制而复制，并随细胞分裂分离到子代细胞中，能保持恒定的拷贝数，表达所携带的遗传信息。基于该特征，质粒作为承载目的基因的重要载体，被广泛地应用在生命科学研究、药物开发、细胞与基因治疗及临床研究等领域中。

　　质粒DNA在细胞与基因治疗（CGT）、基因编辑等领域的具体应用包括：

　　1、裸质粒治疗药物：裸质粒作为基因表达载体，作为蛋白疗法的替代方案；

　　2、DNA疫苗：裸质粒作为抗原编码基因的载体，用作预防性或治疗性DNA疫苗；

　　3、病毒载体原料：重组质粒可用于组装慢病毒(LV)、腺相关病毒(AAV)，用于细胞与基因治疗或基因编辑；

　　4、mRNA/siRNA原料：线性化质粒作为mRNA体外转录模板，是mRNA/siRNA药物的重要上游原料。

　　质粒序列鉴别的必要性及当前痛点问题

　　质粒放行质控对确保生物制药产品的质量和安全性至关重要，但目前定义质粒作为起始材料放行预期的指南是有限的。今年1月份BioPhorum Operations Group(BPOG)发布的《Release Specifications For Plasmid MCBs,Plasmid DNA》文章中总结了关于该主题的关键行业反馈、最佳实践和成员讨论。

　　文章中总结了质粒MCB和质粒DNA质量分析的类别（即鉴别、纯度和效力）和属性以及建议的方法和验收标准。其中特别强调了质粒鉴别序列一致性验证是FDA对任何起始材料在用于药物制造过程之前的要求。质粒序列一致性测试需要在质粒供应商放行时进行，也需要由用户在使用前进行。在执行质量控制放行测试时，供应商可以使用测序和/或限制性消化图谱作为鉴定方法。

　　一般来说，供应商应该对整个质粒序列进行测序，并与参考序列进行比较，同时使用限制酶消化可能有助于定性指导。

　　然而，行业认识到传统的Sanger测序可能很困难，并且由于复杂的挑战需要特殊的方法调整。这源于某些质粒DNA中存在的序列区域的重复性质（如长末端重复[LTR]和反向末端重复[ITR]序列区域）。作为补充，应使用高通量测序NGS技术，它们具有增强的检测能力，可以对质粒DNA的复杂区域进行测序验证。

　　目前，虽然已有Sanger测序及NGS测序等技术用于质粒序列鉴别，但在此过程中还是会遇到各种各样的问题。

　　01）质粒的不稳定性

　　重组质粒在构建及培养过程中有可能由于DNA的插入、缺失或重排等引起结构的不稳定；在传代过程中，大肠杆菌或其他宿主细胞会竭尽全力避免表达质粒转入的外源基因，并且会以意想不到的方式对质粒序列结构进行修改，而这些改变基于目的基因的Sanger测序不太容易检测到。

　　02）超长质粒

　　随着基因合成及分子克隆技术的发展，质粒的外源插入序列也越来越长。普通Sanger测序需要设计测序引物，经过多轮Walking测序，成本很高，速度很慢，且容易失败。

　　03）结构复杂的质粒

　　普通Sanger测序遇到高GC区域经常会发生测序中断的情况，遇到串联重复区域则无法设计引物。大片段重复区域是Sanger测序和NGS短读长测序都很难克服的障碍。

　　04）混合质粒

　　在实验室操作过程中质粒样本中可能会引入其他质粒的气溶胶污染，而在质粒的大量生产过程中CMO/CDMO会将不同质粒共线生产，也会造成不同质粒间的相互污染，那最终的产品可能就不是理想中的单克隆质粒了，Sanger测序基于目标克隆序列设计引物测序无法检测到混合质粒的存在。

　　05）多聚体质粒

　　一般而言，绝大多数质粒在重组大肠杆菌中都能稳定传代，但比如mRNA模板质粒由于其特殊的Poly(A)结构，在重组酶的作用会导致二聚体、四聚体等多聚体的产生。如何确定样本中是否存在多聚体，传统的Sanger测序不会告诉你答案。