北京百欧博伟艰难梭菌培养条件及注意事项

　　一、菌种简介

　　艰难梭菌（Clostridioides difficile）对氧极为敏感，分离培养较困难．故命名为艰难梭菌。艰难梭菌属厌氧性细菌。厌氧性细菌是指那些在无氧条件下要比在有氧环境中生长好的细菌，而人的肠道正好是一个相对无氧的环境。

　　艰难梭菌为革兰阳性粗大杆菌，有鞭毛，卵圆形芽胞位于次极端。芽胞在外环境可存活数月。分离培养基常用环丝氨酸一甘露醇等特殊培养基。艰难梭菌能形成芽胞，对热力、干燥、消毒剂等理化因素均有强大的耐受性，在干燥、消毒剂环境中可存活数月，在衣服、家具和环境中广泛存在。

　　艰难梭菌是人类肠道正常菌群成员，不规范使用抗生素时，可导致肠道菌群失调。耐药的艰难梭菌大量生长繁殖，导致抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎等疾病。培养特性

　　严格厌氧.在厌氧血琼脂平板上35℃培养48 h.形成直径为3-5 mm、圆形、白色或淡黄色、边缘不整齐、表面粗糙、不溶血的菌落。在CCFA（环丝氨酸、头孢甲氧霉素、果糖和卵黄琼脂）平板上产生较大、表面粗糙、边缘不整齐的黄色菌落。在紫外线照射下见黄绿色荧光。

　　二、储存条件

　　斜面菌种和安瓿瓶冻干菌种应在2～8°C保存。西林瓶请置于-20°C保存。甘油管请置于-80°C保存;请勿长期置于室温。

　　三、培养条件

　　1、培养基编号：含去纤维蛋白酶羊血的胰酪胨大豆琼脂培养基

　　2、培养基成分：胰蛋白胨15.0 g；大豆蛋白胨5.0 g；NaCl 5.0 g；脱纤维羊血（灭菌后添加）50.0 mL；琼脂15.0 g；蒸馏水1000.0 mL；以上成分121℃，灭菌15 min，冷却到50℃，添加脱纤维羊血，轻轻混匀。液体培养基不添加琼脂。

　　3、需氧类型：厌氧

　　4、培养温度：36℃

　　四、注意事项

　　1、菌种常规培养时间：细菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌7-10天。2、试管斜面菌种请尽快转接，不建议长期存放。

　　3、初次使用时请按照本说明书推荐条件进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。

　　4、使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。使用说明书

　　1、安瓿瓶开封：用浸过75％酒精的脱脂棉檫试冻干管表面进行消毒，将管顶端于酒精灯外焰上均匀加热；立即滴2-3滴无菌水于加热部位，使管壁破裂；再用镊子或其他适宜工具敲下破裂处。

　　2、菌株恢复培养：用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基(固体培养基去掉琼脂即可)于冻干管中将冻干菌粉全部溶解。将溶解后的菌悬液转移至盛有4~5mL液体培养基的试管中混匀，并取100μL转接到固体培养基上。将液体试管和斜面试管于推荐条件下静置培养。以液体培养结果为准。

　　3、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在2-8℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，需要转接至2-3代恢复活力。

　　4、冻干管打开后需一次用完，不能留存。

　　5、打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

　　6、打管操作应在烧杯或托盘上方进行，用完冻干管应灭菌处理后丢弃。7、如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌种后2个月内联系，逾期不予受理。8、甘油管使用：使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。