细胞转染总是失败？很有可能是实验过程中忽略了这几个关键点

　　什么是细胞转染？

　　细胞转染（Transfection）是指将外源性基因（如DNA、RNA、蛋白质等）导入到细胞内的技术。

　　转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。

　　随着基因和蛋白功能的深入研究，转染已经成为科研实验中最常用的技术手段之一。研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

　　细胞转染的分类

　　根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬时转染和稳定转染。

　　瞬时转染（transient transfection）：指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内，该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。

　　细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。多用于启动子和其他调控元件的分析。

　　目前，由于各种转染试剂的发明，哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。

　　稳定转染（Stable transfected）：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。与瞬时转染不同，稳定转染能够整合到宿主基因组，因此转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的DNA。

　　由于稳转效率较低，因此选用有效地转染策略和筛选方法很重要。根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。

　　细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也带负电荷。为了使核酸穿过细胞膜，研究人员开发了多种技术，大致分为三类：

　　■化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。如阳离子脂质体方法、磷酸钙共沉淀法、其他阳离子物质介导等技术。

　　■生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。现在比较多见的是各种病毒介导的转染技术。

　　■物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA。如电穿孔法、显微注射法。然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据自己的细胞类型和实验需求进行选择。

　　理想的细胞转染方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。

　　在转染过程中需注意事项

　　（1）转染试剂

　　不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。

　　每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。

　　当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。

　　不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。

　　做转染实验时，除了要选择合适的转染试剂，要想获得最优的转染效果，还需要对转染条件进行优化。

　　细胞转染效率往往受到很多因素的影响，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑，所以细胞转染是一个常规但并不简单的实验。

　　下面以阳离子脂质体介导的转染为例，一起了解一下在转染过程中还需要注意哪些因素吧！

　　（2）细胞状态和密度

　　转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。

　　细胞状态不好，会导致转染效率低下，为确保良好的细胞状态需注意以下几点：

　　选择传代次数较低并处于对数生长期的细胞进行转染。

　　细胞密度（%汇合度）达到60%-80%时，再进行转染，此时转染效率较高。切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。

　　同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从而影响实验结果。一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时候收细胞进行功能检测。细胞污染也会造成转染效率低下，应注意防止细胞污染。

　　培养物可被细菌、真菌、病毒、支原体或其他细胞种类所污染，各种污染均会导致结果错误。

　　其中支原体污染会严重影响细胞转染的效率，且支原体污染一般难以察觉（不会像细菌污染那么明显可见）。培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，包括酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。因此，必需进行支原体污染的常规筛查。（2）使用优质DNA

　　DNA的质量影响转染效率：

　　脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA的纯度差，则其携带的少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的效率。

　　含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。

　　为实现高效率、低毒性的转染，应使用高质量的DNA（高纯度、无菌、无内毒素）。

　　使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA；

　　通过测量OD值来确定DNA纯度和浓度，OD 260/280值应介于1.7-1.9之间，越接近1.8越好。读数小于1.8，表明样品可能被芳香族产物（即苯酚）或蛋白质污染；读数大于2.0，则表明样品被RNA污染。

　　当转染的DNA会编码对细胞有毒害作用的产物时，可使用弱启动子或可诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。（3）选择合适浓度的DNA

　　不同细胞系转染效率通常不同，需要进行预实验，选择合适浓度的DNA，以获得较高的转染效率。

　　不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。

　　（4）转染时，小心轻柔的将脂质体加到培养基中并轻轻混匀，避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。

　　（5）血清

　　脂质体转染过程中不是必须需使用无血清培养基，因为血清会影响复合物的形成（蛋白质可能会干扰复合体的形）。一旦复合体形成，即可将其加入到含血清培养基的细胞中。（6）在转染的过程中，是否可以在培养基中使用抗生素？

　　不可以，抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。（7）转染完成后需要对转染效率进行检测，常用的转染效率检测方法有以下几种：

　　设置阴性和阳性对照：一般在转染后24-48h，靶基因即在细胞内表达。可依据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测等实验。

　　■使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和GFP蛋白表达细胞的百分比。利用含GFP或RFP之类报告基因的质粒作为阳性对照（阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与目的质粒共转染），评估转染效率。

　　■利用qPCR法精确定量目的基因。

　　■WB检测敲减或者过表达蛋白。（8）转染后发现转染效率不高，可以通过两种方法：

　　1、复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。

　　2、通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。