酿酒酵母的筛选鉴定及应用方向

　　一、酿酒酵母形态特征

　　酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用于制作面包和馒头等食品及酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，在白酒工业中常用酵母菌的直径多为4~6μm。其繁殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物。酿酒酵母被认为是最具潜力的大规模生产菌种。野生型酿酒酵母的主产物为乙醇。

　　酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。同时，酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。酿酒酵母也被用于其他具有重要工业价值代谢产物的发酵。

　　酿酒酵母是单细胞，卵圆形或球形，具细胞壁、细胞质膜、细胞核（极微小，常不易见到）、液泡、线粒体及各种贮藏物质，如油滴、肝糖等。酿酒酵母生长在麦芽汁琼脂培养基上的酿酒酵母菌落为乳白色，有光泽、平坦、边缘整齐；细胞宽度2.5-10μm，长度4.5-21μm，长与宽之比为1-2，多为圆形、卵圆形或卵形。

　　酿酒酵母细胞壁为双层结构，内层是由β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖组成的葡聚糖层，在出现牙痕的附近还含有一定数量的几丁质。外层是由性质不同的各种甘露糖蛋白组成。在酵母细胞壁中，甘露糖蛋白是酵母细胞壁的重要组成部分，它除了可以参与酵母细胞之间的交配外，还与菌落形态变化以及生物大分子的免疫识别等相关。

　　二、生长条件

　　酿酒酵母在自然界中分布较广，属兼性厌氧微生物。繁殖时需要大量的氧气，而酒精发酵时就不需要氧气。

　　酿酒酵母的生长速率明显受到环境变化的影响，其中温度和pH值是主要的两个方面。温度是一种几乎可以影响细胞内所有生物化学进程的因素。高温可使一些蛋白、DNA、RNA变性，并且会影响细胞生物膜的结构和功能，而低温会抑制细胞内参加代谢反应酶的活性，从而影响酿酒酵母的生长。酿酒酵母最适生长温度为28-30℃，培养温度若高于45℃，酿酒酵母会对温度非常敏感；培养温度若在50℃持续5 min，酿酒酵母菌株99%会死亡。

　　大多数酿酒酵母能在pH值为2.5-8.0的培养基中生长，由于酿酒酵母有嗜酸性，根据培养温度、氧化应激、培养基和菌株的不同，最佳生长pH值约在4-6之间。培养基初始pH值过高或过低均会影响酵母菌的生长。Liu等研究发现，当pH值低于3时，酵母菌的停滞期会延长；当pH值在2.5时，酵母菌生长完全被抑制；Antonio等发现，当pH值为8时酵母菌生长速度显著降低，pH值为9时生长完全停止。

　　此外，氧化应激、培养基组成、渗透压等因素均会影响酿酒酵母的生长。

　　三、筛选与鉴定

　　1、筛选

　　酿酒酵母的无性繁殖方式筛选。对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。

　　WL琼脂培养基筛选酿酒酵母。将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养Sd后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。

　　赖氨酸培养基筛选。接种液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种酵母到5mL无菌水中进行饥饿处理，5d后，接种到赖氨酸培养基，27℃培养5d后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d后仍无菌落生长说明可能是酿酒酵母。

　　2、鉴定

　　形态与培养特征。将菌种接种到液体培养基中，25℃培养3-7d，观察是否发酵、培养液是否浑浊，是否形成环或岛，沉淀量多少及松紧状况，并制水浸片于显微镜下观察，记录酵母的无性繁殖方式与细胞的形状。将酵母在琼脂培养基上划线，于28℃培养3-4d，观察其菌落形态。

　　酵母假菌丝的观察。将菌株在25℃活化后，在琼脂平板上划线接种（每个平板2-3条），在菌线上盖上无菌盖玻片，在28℃下培养5-10d。

　　酵母菌子囊孢子的观察。把产子囊孢子培养基做成斜面；菌株在25℃琼脂培养基活化1-2d后，接种到生孢培养基斜面上划线，25℃培养3d，镜检是否有子囊孢子。凡未见孢子的在17℃左右保持4-6周，每周再检查是否出现子囊孢子。

　　应用方向

　　酿酒酵母作为单细胞真核生物的代表，发酵工艺成熟，生物安全性高，主要用于燃料乙醇、白酒、葡萄酒、啤酒等的酿造生产中。酿酒酵母活菌、非活性成分及细胞组成成分也已广泛应用于畜牧养殖业和饲料工业。

　　在酿酒工业上的应用

　　酵母菌将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和乙醇，此作用即发酵。

　　酿酒酵母乙醇生成途径：葡萄糖是很容易利用的碳源，许多微生物都能够利用葡萄糖发酵生产乙醇。酵母菌在厌氧条件下进行葡萄糖乙醇发酵，发酵过程包括葡萄糖酵解和丙酮酸的无氧降解两大生化反应过程。该过程主要由两个阶段组成，第一阶段葡萄糖通过糖酵解途径分解成丙酮酸；第二阶段丙酮酸由脱羧酶催化生成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原成乙醇。

　　在畜牧养殖业上的应用

　　活菌可以作为益生菌或发酵菌剂使用。酿酒酵母属于兼性厌氧菌，在进入动物胃肠道后，可以消耗胃肠道的氧气，造成厌氧环境，从而促进有益菌群的繁殖，改善动物消化道微生态平衡。体外试验研究表明，酿酒酵母还可以有效吸附肠道病原菌（鼠伤寒沙门氏菌）。布拉迪酵母是属于酵母属、酿酒酵母亚种的一种酵母，大部分酿酒酵母最适生长和代谢温度为30℃，而布拉迪酵母菌株具有天然耐热性，在37℃生长良好。目前布拉迪酵母已作为一种非毒性酵母菌，在欧洲、南美、非洲等地区广泛应用于腹泻治疗。研究表明，布拉迪酵母菌株耐酸性能良好，pH 2条件下1h存活率达75%。布拉迪酵母可以分泌多胺物质（腐胺、精胺和亚精胺），促进动物肠道成熟，增强肠细胞对营养物质的吸收能力。在妊娠和泌乳日粮中添加布拉迪酵母，降低了母猪后肠微生物菌群大肠杆菌和产气荚膜梭菌总数。

　　酿酒酵母可以作为发酵菌剂使用，或与其他益生菌配伍，用于饲用原料的发酵处理，提升原料价值。如利用酿酒酵母固态发酵白酒糟生产蛋白饲料；利用酿酒酵母菌和植物乳杆菌混合发酵玉米加工副产物；通过酿酒酵母对玉米浆中亚硫酸盐进行无机硫的转化，降低其亚硫酸盐含量。采用酿酒酵母（4%）和米曲霉（0.5%）复合菌种发酵豆粕，发酵豆粕中的粗蛋白质和酸溶蛋白分别提高21.27%、695.97%。