人视网膜微血管内皮细胞培养操作及应用

　　细胞名称：人视网膜血管内皮细胞HRCEC

　　产品规格:T25培养瓶冻存管

　　细胞数量:1x10^6

　　保存温度:37℃-198℃

　　运输方式:常温保温运输干冰运输

　　安全等级:1

　　用途限制:仅供科研

　　培养体系:ECM培养基（Sciencell）+10%胎牛血清+1%双抗

　　培养温度:37℃

　　二氧化碳浓度:5%

　　简介:HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）指的是人视网膜毛细血管内皮细胞。这些细胞在视网膜的血管系统中扮演着重要的角色，负责维持视网膜的血液供应和营养物质的交换。

　　HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）培养操作

　　1)复苏HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

　　将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

　　2)HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

　　c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

　　d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

　　3)HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

　　a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

　　b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

　　c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

　　应用

　　HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）可以用于阿魏酸钠对高糖环境下人视网膜内皮细胞的增殖作用以及VEGF表达的影响

　　研究不同浓度的阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)对体外高糖环境下培养的人视网膜血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells,HRCEC)的增殖以及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。从而为糖尿病视网膜病变早期的预防及治疗提供新的研究思路以及理论依据。

　　方法：眼科手术所提取的HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）进行体外培养，通过免疫细胞化学方法检测FⅧr-Ag鉴定培养的HRCEC。取第3～4代生长良好的细胞进行实验,实验设置分组为空白对照组、低糖对照组、高糖对照组、高糖+不同浓度阿魏酸(1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L)组,用噻唑蓝比色法(MTT)检测48h后不同质量浓度的阿魏酸钠对体外高糖环境下HRCEC增殖作用，通过免疫细胞化学法观察细胞VEGF的表达情况。

　　结果1、免疫细胞化学检测体外原代培养的HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞），Ⅷ因子相关抗原抗体染色，呈阳性染色；

　　2、MTT比色法结果显示：用1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L的阿魏酸钠作用于原代培养的高糖环境下HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）48h，细胞增殖抑制率分别为46.97%、61.55%、76.91%、83.47%。在相同的时间作用条件下，一定质量浓度范围的阿魏酸钠对高糖环境下HRCEC的增殖具有抑制作用（P<0.05），随着药物浓度的增加，细胞存活率反而逐渐下降，抑制率逐渐提高。低糖对照组与高糖对照组相比较结果无明显统计学意义（P=0.068>0.05）。

　　3、免疫化学法检测显示：低糖对照组、高糖对照组与不同浓度的阿魏酸钠（1mg/L，2mg/L，4mg/L）作用于HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）48h后化学背景灰度值与阳性灰度值之差分别为28.27±1.62，93.67±0.81，72.67±2.89，53.73±1.70，30.93±3.72。通过48h后加药组和高糖对照组相比，VEGF表达明显下降，差异性明显，且均有统计学意义(均为P<0.05)，具有质量浓度依赖性。与低糖对照组相比，高糖对照组VEGF的表达明显增加(P<0.05)。

　　结论1、阿魏酸钠对体外环高糖境下培养的HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）的增殖具有抑制作用，且呈质量浓度依赖性，并能诱导细胞凋亡。2、阿魏酸钠可以下调HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）在体外高糖环境下培养的VEGF的表达，呈现质量浓度依赖性；3、阿魏酸钠抑制视网膜新生血管可能是通过下调HRCEC（人视网膜毛细血管内皮细胞）中VEGF表达。