脱氮付球菌菌种简介及在水体氮素转化中的作用研究

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　　一、菌种简介

　　平台编号：bio-52960

　　拉丁属名：Paracoccus denitrificans

　　菌株名称：脱氮付球菌

　　其它编号：ATCC19367

　　培养基编号：2

　　培养温度：30

　　培养时间：18-24小时

　　用途：研究

　　使用范围：仅供科研使用

　　注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用

　　保藏条件：斜面菌种和冻干菌种应在2-8°C保存。请勿长期置于室温

　　二、培养基

　　*营养琼脂培养基（NA）

　　*胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）

　　*LB培养基（以上培养基三选一即可）

　　三、培养方法

　　培养基乳酸菌培养基：Lacto-casein peptone(乳酪蛋白胨)10g Beef extract 10g Yeast extract(酵母膏)5g Glucose(葡萄糖)5g Tween(吐温)80 1g K2HPO4 2g Na-acetate(醋酸钠)5g Diamine citrate(柠檬酸二胺)2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water(蒸馏水)1000m pH 6.5-6.8。121，15min。

　　四、传代方法

　　冻干管：75%酒精擦拭管壁，后用砂轮在冻干管壁划两圈，掰断，用200μL无菌水或培养基充分溶解，平板涂布，活化培养。

　　斜面：试管口用75%酒精擦拭后，火焰灼烧，后用无菌接种铲切块，挑取接入平板或斜面，培养。

　　五、保藏方法

　　1、低温存法：

　　简单保存法，将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4冰箱保存,保存时间不超过1～2个月，若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3～4个月；

　　液氮超低温保存法，将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内，然后控制冷却速度，使安瓿管温度逐步下降至-35时，即可置于-150～-196的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物，都可用此法长期保存。

　　2、脱水存法：

　　沙土保存法，能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合，经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内,装置高度为1cm;灭菌2～3次，烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子，用无菌蒸馏水2～2.5ml制成孢子悬液，吸取少许加入沙土管中，经真空抽干，外观呈松散状态,于4冰箱保存，保存期可达5～7年。

　　冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂（一般用脱脂牛奶或血清）相混合，放在安瓿管内于-20～-30的乙醇浴中速冻。然后，在低温下用真空泵抽干，并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻，熔封安瓿管，于低温下保存。保存期可达5～10年之久。

　　石蜡油封存法，在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油，高出斜面1cm，于4冰箱或低温干燥处保存，此法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物，保存期为一年以上。

　　六、使用范围

　　（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，酿酒酵母菌组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

　　（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。

　　（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

　　七、脱氮付球菌在水体氮素转化中的作用研究

　　养殖水体中适量的氮素可以维护水体的生态平衡,但高浓度氮素会毒害养殖动物,污染生态环境。传统理论认为反硝化必须在厌氧或缺氧条件下才能发生,但养殖水体需要充足的溶氧作保证,因此,这极大限制了反硝化菌在养殖水体中脱氮的应用。以一株好氧反硝化菌一脱氮副球菌(Paracoccus denitrifican,ACCC10489)为试验对象,研究了其菌体和菌落的形态、生理生化特性、适宜生长条件和生长曲线、好氧反硝化特性和影响因素、转化氮素的可能途径、应用的安全性及在养殖水体中转化氮素的能力和效果。研究结果表明：

　　1、脱氮副球菌是一种兼性细菌,在好氧或缺氧条件下均能生存和生长,但其特性主要体现在好氧方面,其在氧气充足时生长快速,在氧气缺乏时生长缓慢。

　　2、无论在好氧还是缺氧条件下,脱氮副球菌的适宜生长温度均为30℃,适宜生长的pH值均为7.0。此温度与pH范围非常有利于脱氮副球菌在水产养殖领域的实践应用。

　　3、脱氮副球菌可以在好氧条件下进行反硝化作用,反硝化过程主要发生在菌体生长的对数期。在葡萄糖、甲醇、乙酸钠、酒石酸钾钠和丙三醇这5种碳源中,利用度最佳的碳源是葡萄糖,最适C/N摩尔比为15-20。

　　4、不同溶氧条件下,脱氮副球菌对单独或混合存在的三种形式的无机氮(NO3--N、N02--N和NH4+-N)均有良好的转化去除效果,最高转化去除率均大于90%,但转化去除的方式、路径有所不同。当水中N03--N或N02--N单独存在时,脱氮副球菌通过同化吸收和反硝化作用这两条路径来完成转化功能,主要的影响因素是水中的溶氧。在一定的溶氧范围内,溶氧越高,细菌体内的异化型硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的活性越低,反硝化能力越弱,同化吸收能力越强；当水中的NH4+-N与N03--N或N02--N共存时,无论NH4+-N的含量有多少、水体处于何种溶氧水平,脱氮副球菌总是优先利用NH4+-N,通过同化吸收合成菌体物质,几乎全部通过好氧反硝化作用转化去除N03--N和N02--N。只有当NH4+-N消耗殆尽而N03--N或N02--N还有剩余时才会部分同化N03--N或N02--N,供菌体生长。

　　5、脱氮副球菌通过水体接触方式,在10g·L-1的用量下对斑马鱼没有毒性,况且其本身也存在于天然水体环境中,因此具有生态安全性,可应用于水产养殖水体的氮素污染控制。

　　6、将脱氮副球菌应用于溶氧浓度为4.0～5.1mg.L-1的鱼类养殖池塘中,其对养殖水体中的NH4+-N、N02--N、N03--N均具有较好的转化去除效果,平均去除率均40%,同时它还对COD有一定的去除效果。这种水质控制效果在一定范围内随菌液用量的增加和作用时间的延长而愈发显著。考虑到实际应用的经济有效性,适宜的用量以1000mL·(亩·米)-1(菌体浓度≥109CFU.mL-1)为佳,有效作用时间为10d。研究表明,脱氮副球菌的好氧反硝化作用解决了水产养殖水体必须有氧和反硝化脱氮必须厌氧或缺氧这一矛盾,为养殖水体中氮素污染的防治提供了一条新的思路。