提了这么久质粒或许应该学习一下原理知识啦!

　　在做实验的时候师兄师姐可能只会告诉你实验步骤，告诉你如何操作，很少有师兄师姐会有时间告诉你实验的原理，但是我觉得实验原理是我们必须掌握的呦今天一起学习质粒提取的原理及步骤哦！

　　一、质粒简介

　　质粒(Plasmid),作为生物科学领域的一个关键元素,最早在20世纪50年代初期被科学家们在大肠杆菌中发现。它是一种独立于细菌、酵母菌、放线菌等生物染色体之外的闭合环状双链DNA分子。这种独特的DNA分子具有自主复制的能力,意味着它可以在生物体内自行复制,并在子代细胞中保持恒定的拷贝数。更为神奇的是,质粒还能够表达它所携带的遗传信息,这使得它在基因工程中具有极高的应用价值。如今,质粒已经成为基因工程中不可或缺的一部分,被广泛用作一种简单而有效的载体。在科研领域,可以利用质粒来克隆、表达和改造基因,以研究基因的功能和调控机制。

　　二、质粒提取原理

　　细菌质粒作为一类环状双链DNA,大小从1Kb至200Kb以上不等,它们存在于细胞质中,独立于细胞染色体之外,并具备自主复制的能力。

　　实验室中常用的质粒提取方法是碱裂解法。

　　碱裂解法的原理:

　　1.菌体裂解:菌体在氢氧化钠(NaOH)和十二烷基硫酸钠(SDS)的混合溶液中裂解,导致蛋白质和DNA发生变性。

　　2.DNA复性:当加入中和液(如乙酸钾)后,溶液的pH值恢复中性,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态。

　　3.离心分离:在离心过程中,由于质粒DNA分子较小且复性迅速,它们会留在上清液中;而蛋白质与细菌基因组DNA由于缠绕形成絮状沉淀,在离心时会被沉淀下来。

　　4.质粒纯化:上清液中的质粒DNA可以通过吸附法进一步纯化。

　　质粒的粗提取物通常包含以下三种构型的质粒DNA:

　　1.共价闭合环状DNA(cccDNA):这是质粒DNA最常见的构型。在此构型中,质粒的两条链没有断裂,形成一个完整的闭环结构。具有高度的稳定性和完整性,是基因工程中常用的质粒构型。

　　2.超螺旋开环DNA(ocDNA):在这种构型中,质粒的一条链断裂,形成一个超级螺旋的开环结构。ocDNA的稳定性稍逊于cccDNA,但仍可用于某些实验。

　　3.松弛的环状分子线形DNA(IDNA):IDNA构型中,质粒的两条链均断裂,形成一个松弛的环形结构。1DNA的稳定性较差,通常在质粒提取过程中产生较少。

　　三、质粒提取中各溶液的作用

　　溶液P1(悬浮液)

　　主要成分:Tris-HCI(pH8.0)、EDTA、葡萄糖

　　作用:

　　悬浮菌体:溶液P1使菌体悬浮起来,防止菌体在短时间内沉降。

　　维持pH稳定:Tris-HCI作为缓冲溶液,有助于保持反应体系的pH稳定;

　　抑制DNase活性:EDTA与微生物体内的Mg”、Ca2等金属离子结合,从而抑制DNase的活性,防止DNA降解;

　　增加溶液黏度:葡萄糖能增加溶液的黏度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA。

　　注意事项:溶液P1需要在使用前加入RNA酶(RNaseA)以降解溶液中的RNA,并保存在4°C以防止蛋白质失活。

　　溶液P2(裂解液)

　　主要成分:NaOH和SDS

　　作用:细胞裂解:NaOH破坏细胞膜的双层结构,使其转化为微囊结构,实现细胞裂解;

　　沉淀蛋白质:sDs在后续步骤中发挥作用,与蛋白质结合并使其变性,便于后续分离。注意事项:添加溶液P2时需要控制时间和避免剧烈震动,以防止基因组DNA断裂并污染样品。

　　溶液N3或溶液P3(中和液)

　　主要成分:醋酸钠(如3mol/L NaAc(pH4.8)溶液)

　　作用:中和NaOH:溶液N3/P3的主要作用是中和第二步加入的强碱,如NaOH,使溶液pH回归中性。chromosomal DNA发生复性,但是无法恢复原来天然的双链结构,而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让SDS-protein-chromosomalDNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心,sDS-protein-chromosomalDNA复合物,其他的细胞裂解物全部沉淀管底,只有plasmidDNA溶解在上清中。

　　四、质粒提取中步骤

　　步骤1:摇菌

　　1.涂布菌液:将已经通过测序验证正确的克隆菌液均匀地涂在含有LB培养基的固体平板上。

　　2.恒温培养:放入37℃的恒温培养箱中,培养经过12到16小时,平板上就会长出许多肉眼可见的菌落

　　3.准备液体培养基:准备一些15ml的离心管,并在每个离心管中加入5ml的LB液体培养基。这些培养基中还添加了抗生素,目的是杀死那些不含目标质粒的细菌,确保只有含有目标质粒的细菌能够生长。

　　4.挑取单克隆:用无菌的工具(如接种环或枪头)从平板上挑取一个单独的菌落,然后将其放入一个含有抗生素的LB液体培养基中。每个培养基只放一个菌落。

　　5.振荡培养:将这些含有细菌的培养基放入恒温摇床中,设定温度为37℃,转速为180转每分钟(rpm),培养过夜。

　　步骤2:收获菌体并提取

　　质粒提取主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案进行选择,今天为大家介绍碱裂解法,用的是试剂盒提取,直接附上试剂盒的说明书了哦!