如何养好贴壁细胞，请速查收这份攻略！

　　贴壁细胞培养攻略

　　一，贴壁细胞的分类及形态

　　贴壁细胞一般分为皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型。

　　在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其它形态，而且晃动培养液时，细胞不动。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。

　　二，实验材料与仪器

　　实验材料：细胞、PBS或DPBS、0.25%(w/v)Trypsin-EDTA、75%乙醇、培养基、100X双抗（链霉素-青霉素）、胎牛血清、细胞冻存液。

　　实验仪器及耗材：培养皿或培养瓶、移液枪、离心管、记号笔、封口膜、冻存管、程序降温冻存盒、液氮罐、离心机、37℃恒温培养箱（5%二氧化碳浓度）、倒置相差显微镜、冰箱、无菌细胞操作台。

　　三，实验步骤

　　1.试剂准备

　　DMEM完全培养基（10%胎牛血清）：44.5 mL DMEM+5 mL胎牛血清+500μL 100X双抗，摇匀，4℃冷藏保存，使用前于37℃恒温水浴锅中预热15分钟。

　　PBS、完全培养基、根据细胞特性选择合适的解离液或机械吹打消化细胞、胰蛋白酶解离剂0.25%(w/v)Trypsin-EDTA于4℃冷藏保存，使用前于37℃恒温水浴中锅预热15分钟。

　　2.细胞复苏

　　1)超净工作台使用前紫外线照射30分钟。使用前，后用75%酒精擦拭台面。保持台面干净整洁。使用时一定打开通风。

　　2)将冻存细胞从-80度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2分钟内）37℃恒温水浴中预热水浴锅中（或在手心中反复摩擦），不停晃动以化冻。

　　3)立刻将化冻的细胞液转移进装有3 mL DMEM完全培养基的5 mL离心管中并吸打均匀。注意液体不要留在瓶口或瓶盖上，避免增加污染的可能。

　　4)复苏细胞时，离心机提前降温至4℃，以1000 rpm的转速将细胞悬液离心5分钟并弃上清。

　　5)用3 mL DMEM完全培养基重悬细胞，并转移进6 cm细胞培养皿中，放入细胞培养箱中。

　　6)在显微镜下观察复苏细胞的状态，并及时更换DMEM完全培养基。

　　7)当细胞密度占显微镜视野80%～90%时，应进行细胞传代。

　　3.贴壁细胞传代（以6 cm细胞培养皿为例）

　　1)弃置原培养皿中的培养基，从培养皿边缘加入2 mL预热的PBS平衡盐溶液润洗细胞（注意不要直接冲到细胞表面）。

　　2)沿培养基侧壁加入1 mL预热的0.25%(w/v)Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆盖细胞表面。于细胞培养箱中孵育，孵育时间根据细胞的特点而定。

　　3)向培养皿中加入1 mL完全培养基中和Trypsin的作用，并轻轻吸打细胞表层数次。将细胞悬液转移到5 mL离心管中，在室温下以1000 rpm的转速将细胞悬液离心3分钟。

　　4)小心弃去离心管中的上清液，使用1mL完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，使其完全被吹打为单个细胞状态，尽量减少泡沫的产生。

　　5)进行细胞计数后以1:3（1:3～1:6均可）的比例进行细胞传代。

　　6)取三只新6 cm细胞培养皿，每只培养皿中加入3 mL完全培养基，将细胞悬液平均分配至三只培养皿中，盖上盖子后，按照画十字的操作，将细胞摇匀。

　　7)细胞培养皿放入细胞培养箱中，继续培养，每天观察细胞状态并及时更换培养液。

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