需钠弧菌Vibrio Natriegens培养及打管培养说明

　　需钠弧菌常用于实验和科研检测用，属于菌株类。

　　一、菌种简介

　　平台编号：Bio-57189

　　规格：冻干物

　　拉丁属名：Vibrio Natriegens

　　中文名称：需钠弧菌

　　属名：Vibrio

　　种名加词：natriegens

　　其它中心编号：=CGMCC 1.8729=NBRC 15636=ATCC 14048=CIP 103193=DSM 759

　　来源历史：←中科院微生物所←日本NBRC

　　收藏时间：2014.7.24

　　资源归类编码：15131129101

　　模式菌株：模式菌株

　　主要用途：分类；研究；生产

　　具体用途：替卡西林(ticarcillin)检测；固氮。

　　特征特性：16S rDNA序列：X56581

　　生物危害程度：四类

　　致病对象：无

　　分离基物：盐碱滩污泥

　　采集地：美国Sapelo岛，GA

　　培养基：海水2216琼脂55.1g，蒸馏水1.0L，pH7.4。

　　培养温度：24-26℃

　　资源保藏类型：培养物

　　保存方法：-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

　　实物状态：有实物

　　共享方式：公益性共享；资源纯交易性共享；合作研究共享；资源交换性共享

　　用途：分类；研究；生产；替卡西林(Ticarcillin)检测；固氮。

　　注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

　　二、储存条件

　　安瓿冻干和培养物菌种应在2-8°C保存。西林瓶请置于-20°C保存，甘油管请置于-80°C保存;请勿长期置于室温。

　　三、培养条件

　　1、培养基编号：CM0444细菌用海洋液体培养基（可用2216E代替）

　　2、培养基成分：酵母膏1.0g，蛋白胨5.0g，Fe(III)citrate 0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.9g，KCl 0.55g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.80g，Na2CO3 0.16g，KBr 0.08g，SrCl2 34.0mg，H3BO322.0mg，NaSiO3 4.0mg，NaF 2.4mg，NH4NO3 1.6mg，Na2HPO4 8mg，蒸馏水1.0L，pH7.6。推荐使用商品化成品培养基。

　　3、需氧类型：好氧

　　4、培养温度：24-26℃

　　四、培养方法

　　1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。工业发酵的有用菌种,其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

　　2、挑选具有某种能力的有用菌种,也称种子制备,是指菌种在一定条件下,经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

　　3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。

　　4、保存在沙土管或冷冻管中的菌种,用无菌手续挑取少许,接入琼脂斜面培养基上,在25℃(或较高温度)下培养5~7天(或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子(对于霉菌类孢子制备,多数采用大米、小米之类的天然培养基)。

　　5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液,接种到扁瓶固体培养基上,于25~28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干,使水分降至10%以下,并放入4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在上延续使用半年左右。

　　6、如果有些菌种不产孢子,如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如葡萄糖)和氮源(如玉米浆),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%~20%。

　　五、实验内容

　　1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查

　　2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物

　　3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查

　　4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌

　　六、注意事项

　　1）菌株恢复培养：用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基(固体培养基去掉琼脂即可)于冻干管中将冻干菌粉全部溶解。将溶解后的菌悬液转移至盛有4~5mL液体培养基的试管中混匀，并取100μL转接到固体培养基上。将液体试管和斜面试管于推荐条件下静置培养。菌种活化前，请将安瓿管保存在2-8℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，需要转接至2-3代恢复活力。

　　2）经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间；若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

　　3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

　　4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

　　5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为2-25年；

　　6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

　　7）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后2个月内联系，逾期不予受理；

　　8）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

　　9）安瓿瓶开封：用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

　　10）甘油管使用：使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。