五大贴壁细胞培养难题全解析，让你轻松上手！

　　贴壁细胞（adherent cells），这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，如：培养（瓶）器皿壁上，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长，繁殖。细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始进行有丝分裂，并很快进入对数生长期。

　　当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞性或上皮样细胞。贴壁细胞生长过程分为五个时期，分别是游离期、贴壁期、潜伏期、对数期、平台期和衰退期。

　　贴壁细胞因其培养过程较为繁琐，所以培养时更容易出现问题。今天，就围绕贴壁细胞培养中常见的5大常见问题，与大家一起探讨详细原因和解决方法。

　　一，传代后部分细胞漂浮

　　原因及解决方法如下

　　1，传代前细胞密度太大：：一般细胞融合度达到80%时就可以进行传代操作了，传代密度需适中，传代密度过高也会导致传代后漂浮；

　　2，细胞状态不好：可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善；

　　3，吹打次数过多造成机械损伤：轻柔吹打，细胞呈单颗粒时可停止吹打，吹打过程避免气泡产生；

　　4，培养基更换后不适应：更换回原来的培养基；或者与原培养基比例混合后使用，使细胞有个适应期；

　　5，培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因；

　　6，接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质；

　　7，复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。

　　二，传代后细胞变形

　　原因及解决方法如下

　　1，变形，但细胞还在生长：可能是血清批次不一样导致，血清成分复杂，不同批次和品牌间均存在成分差异，影响细胞状态。建议使用同一批次血清，更换血清时需与原血清比例混合后使用，使细胞有过渡期；

　　2，变形，但细胞不长，且碎片增多：可能传代操作过程损伤，常见于消化不当，或者潜在支原体等污染导致细胞病态；消化时间根据每个细胞的状态来调整，消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响；培养过程应严格无菌操作，实验环境尽量洁净，确保细胞无外源污染。

　　三，细胞生长周期变慢，边养边漂

　　原因及解决方法如下

　　1，细胞传代时密度太稀或太密：建议细胞融合度达80%左右进行传代，传代密度适中，密度过低会延长生长周期，密度过高会有接触抑制；

　　2，传代操作不当：根据细胞特性决定细胞消化时间，一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化，难消化的细胞可分次消化，每次时间不超过5min；频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差，常规换液时间间隔为2~3天。

　　四，传代后细胞成团

　　解决方法如下

　　1，低密度接种，延长换液时间，防止细胞脱落；

　　2，使用多聚赖氨酸包被培养器皿，以增加细胞贴壁牢固度，降低细胞聚集成团的几率；

　　3，重新铺板，并更换新配制的培养基，加大血清比例（增加比例不超过5%）；

　　4，接种时，减少培养基量（如T25加3mL）以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后（约8-12小时），再补加培养基到正常用量。

　　五，细胞出现空泡

　　原因及解决方法如下

　　1，正常的细胞活动：有的细胞有正常的自噬行为或其他膜泡活动，无需特殊处理（如Caco-2细胞）；

　　2.血清不适应、培养基成分改变、换液不及时等造成细胞营养不良：可通过更换更合适的血清或及时换液等方法解决；

　　3，机械损伤、PH偏高或偏低等造成细胞受损：注意培养条件及操作手法。

　　六，如何促进细胞贴壁

　　1，适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。

　　2，最好用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。

　　3，正确配制消化液或培养液。

　　4，使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。

　　5，复苏新的细胞，第一周用20%血清帮助细胞复原。

　　6，传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。

　　7，细胞传代24小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。

　　8，体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca2+含量和温度，均有利于上皮细胞生长。

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