HOK人正常口腔角质细胞细胞培养及应用

　　HOK人正常口腔角质细胞

　　平台编号：Bio-133141

　　规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶

　　产品类别：人源细胞系

　　生长特性：贴壁生长

　　培养体系：DMEM（高糖）+10%FBS

　　传代方法：1：2传代

　　细胞形态：上皮细胞样

　　冻存条件：无血清细胞冻存液

　　传代方法消化3-5分钟。1:2传代，3天内可长满。

　　培养体系温度：37℃，气相：95%空气，5%CO2

　　细胞描述本库的细胞仅用于科研工作，未经许可不得用于其他目的，使用者不得将本库细胞转让给第三者。

　　冻存条件无血清细胞冻存液

　　细胞收到后处理：

　　细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置2-4小时。镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入6ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松）

　　HOK人正常口腔角质细胞培养步骤：

　　1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

　　1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

　　3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

　　4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培养液的新皿中或者瓶中。

　　PS：若客户收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代（方法同上）。

　　HOK人正常口腔角质细胞应用

　　用于槲皮素对人口腔角质细胞再生的生物学效应研究

　　用其脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）来模拟体外炎症环境,并且通过检测炎症因子IL-β1和TNF-α的基因表达来验证槲皮素的抗炎效果。

　　方法:（1）体外培养并传代扩增了原代HOKs,本实验用的细胞均于第4代与第五代之间。

　　（2）用CCK-8试剂盒分别检测含有20至200μM的槲皮素对人HOKs的毒性

　　（3）体外检测槲皮素对HOKs增殖能力的影响并与阳性对照表皮生长因子（EGF）做比较

　　（4）进行体外划痕伤创面愈合试验检测槲皮素对HOKs迁移能力的影响,分别在0 h、12 h、24 h和48 h时间点用光学显微镜观察单层细胞创面模型的愈合情况,并与阳性对照EGF做比较

　　（5）用Transwell迁移小室进一步验证槲皮素对HOK迁移能力的影响,24 h后观测HOKs迁移情况,并与阳性对照EGF做比较

　　（6）ELISA法检测创面愈合过程中槲皮素对HOK细胞上清液中TGFβ-1和TGFβ-3的变化

　　（7）利用免疫荧光检测创面愈合初期,TGFβ-3在划痕边缘HOKs上的表达

　　（8）利用Pg.LPS建立体外炎症模型。将HOKs用槲皮素预处理3 h后加入Pg.LPS,48 h后,利用时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）检测TNF-α和IL-1β的表达水平,并与阴性对照组和炎症组比较。同时利用RT-q PCR检测在创伤条件下HOKs中生长因子（TGFβ-1,TGFβ-3）的基因表达水平。

　　结果:（1）用CCK-8试剂进行20-200μM不同浓度的槲皮素对HOKs细胞活性的检测。随着浓度的增加,槲皮素对HOKs的细胞活力有明显抑制作用。我们选出20μM的槲皮素来完成余下的实验。

　　（2）槲皮素对HOKs增殖的影响:实验数据显示,在24 h时间点,槲皮素对细胞增殖无明显影响。在48 h时间点,实验组比阴性对照组高6%,但仍无统计学意义。到了72 h时,加入槲皮素的实验组比阴性对照组,增值率升高15%,有明显统计学差异（p<0.01）。