L8824草鱼肝脏细胞接收处理流程及培养说明

　　一、L8824草鱼肝脏细胞详情

　　细胞外文名：L8824

　　种属：鱼

　　来源：国内

　　培养基：MEM+10%FBS

　　组织：肝脏

　　形态特征：上皮细胞样

　　生长特性：贴壁生长

　　特征特性:草鱼肝脏细胞由长江水产所建立鉴定，用于草鱼基础研究和病毒疾病防治研究。

　　传代方法:1:2传代,4-5天传一代

　　冻存条件:基础培养基+8%DMSO+20%FBS

　　细菌真菌:阴性

　　支原体:阴性

　　二、L8824草鱼肝脏细胞接收处理流程：

　　收到细胞后操作流程：为了确保细胞的活性，收到细胞后请立即操作：如果您收到的是冻存管：1．为了确保细胞的活性，收到细胞后请立即复苏。2．若不能及时复苏细胞，可将冻存管置于液氮中保存。如果您收到的是活细胞：

　　1．严格无菌操作，打开细胞培养瓶。

　　2．将细胞培养瓶内培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议初期使用这批培养基对细胞进行扩增培养；由于运输原因，部分贴壁细胞会脱落，须收集上清离心后重新接种到细胞瓶中，待细胞贴壁后再操作）。

　　3．如果细胞未长满，换液。如果细胞已经长满（饱和度80%左右），传代。*若不能及时处理细胞，可将细胞瓶表面消毒后直接置于28℃培养箱中，静置过夜。第二天如培养基无变黄、变浑浊现象，可按照操作指南处理细胞。

　　换液操作（以T25瓶培养细胞为例）

　　1．将培养瓶内培养基用吸管完全吸出。

　　2．向培养瓶内加入6-8ml新鲜培养基，动作轻柔，避免将细胞吹起。3．将培养瓶置于28℃，5%CO2的培养箱中。参考换液频率：2-3天，换液。传代操作（以T25瓶培养细胞为例）

　　1．将培养瓶内培养基用吸管完全吸出。

　　2．加5ml无菌PBS漂洗细胞一次，吸除所有PBS。3．加消化液1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶溶液充分覆盖细胞表面，37℃消化细胞。

　　4．显微镜下观察细胞，待细胞变圆脱落后（通常1-5min内），加入培养基5ml，并用吸管吸取培养基吹打细胞的整个附着面，使细胞脱落并分散，动作轻柔，避免产生气泡。

　　5．将细胞悬液转入无菌的15ml离心管内，1000rpm离心10min，弃上清，用6-8ml培养基重悬细胞，接种到新的培养瓶中。

　　6．28℃，5%CO2培养箱中培养。参考传代比例：1：2传代，3-5天长满。

　　冻存操作（以T75瓶培养细胞为例）

　　1．配置5ml细胞冻存液，放置4℃预冷。

　　2．将培养瓶内培养基用吸管完全吸出。

　　3．加10ml无菌PBS漂洗细胞一次，吸除所有PBS。4．加消化液3ml，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶溶液充分覆盖细胞表面，37℃消化细胞。

　　5．显微镜下观察细胞，待细胞变圆脱落后（通常1-5min内），加入培养基7ml，并用吸管吸取培养基吹打细胞的整个附着面，使细胞脱落并分散，动作轻柔，避免产生气泡。

　　6．将细胞悬液转入无菌的15ml离心管内，取细胞悬液，计数。7．1000rpm离心10min，弃上清，加适量细胞冻存液，重悬细胞（细胞浓度见参考冻存浓度）。

　　8．将细胞悬液分装到冻存管中，1ml/管。

　　9．将冻存管放置4℃预冷30min。

　　10．将冻存管转入程序降温盒中（程序降温盒需提前在4℃预冷），于-80℃过夜。

　　11．从程序降温盒中取出冻存管，快速转移到液氮中保存。参考冻存浓度：4*106/ml参考冻存液配方：DMSO：10%FBS：10%完全培养基：80%

　　复苏操作（以T25瓶培养细胞为例）

　　1．戴好防护面罩，从液氮罐中迅速将冻存管取出并投入37℃恒温水浴锅中，同时用手快速摇动使细胞悬液快速融化，整个过程在20～60秒内完成。

　　2．取出冻存管，擦干水分，用75%酒精棉球消毒后移入生物安全柜，打开旋盖用吸管将细胞悬液转入无菌15ml离心管中，并加入5ml新鲜培养基混匀，1000rpm离心10min。

　　3．弃上清，加入新鲜的培养基6-8ml，重悬细胞后转入T-25培养瓶中，盖上瓶塞，轻轻摇匀后放入28℃，5%CO2培养箱中培养。

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