KG-1A人急性骨髓白血病细胞系的特点与应用！

　　一、背景

　　KG-1A人急性骨髓白血病细胞系是一种人类急性髓系白血病的细胞系，来源于中国医学科学院血液学研究所。该细胞系具有高度致死性、易产生耐药性和易发生突变等特点，因此在临床治疗中应用较为有限。

　　二、KG-1A人急性骨髓白血病细胞系具有以下特点

　　1、来源：KG-1A细胞系是由中国医科大学附属第一医院的研究人员从中国健康人群中分离出来的，因此具有较高的亲缘关系和代表性。

　　2、分化程度：KG-1A细胞系的分化程度较低，即原始造血干细胞水平，这使得它在体外培养时具有较强的增殖能力和抗凋亡能力。

　　3、基因组特征：KG-1A细胞系具有较丰富的基因突变，包括常见的染色体易位、缺失、插入等，这些突变为研究AML的分子机制提供了丰富的资源。

　　4、临床应用：由于KG-1A细胞系具有较强的体外生长能力和较好的体内移植潜力，因此在AML的基础研究和临床治疗中具有重要价值。

　　三、KG-1A人急性骨髓白血病细胞系培养步骤

　　1、准备培养基：使用含有葡萄糖、氨基酸、维生素和矿物质的LB(Luria-Bertani)培养基。将培养基加入高压灭菌器中进行灭菌，然后将其放入37°C、5%CO2的恒温培养箱中预热至37°C。

　　2、收集细胞样本：从患者体内采集骨髓或外周血样本，并按照标准操作规程处理样本。通常采用Ficoll-Paque或Percoll离心法分离出白血病细胞。

　　3、洗涤细胞：用生理盐水洗涤细胞两次，以去除残留的血液成分和杂质。

　　4、添加抗生素：将0.5μg/ml的gentamicin或kanamycin添加到培养基中，以防止细菌污染。

　　5、分瓶培养：将洗涤后的细胞悬液加入到预先准备好的无菌试管中，每个试管加入约100μl的细胞悬液。将试管标记上患者的姓名和日期，并将它们放置在37°C、5%CO2的恒温培养箱中。

　　6、细胞生长与传代：观察细胞的生长情况，当细胞密度达到80%时，需要进行传代。传代的方法是将细胞悬液转移到新的无菌试管中，每瓶加入10-20ml的新鲜培养基，并在37°C、5%CO2的恒温培养箱中继续培养。

　　四、应用

　　KG-1A人急性骨髓白血病细胞系可以用于KG1a耐药细胞的构建及其通过sEVs改变受体细胞耐药性的研究：

　　通过地西他滨梯度诱导构建了一株耐受地西他滨的KG1a(急性髓系白血病细胞),以下简称KG1a-DAC。通过检测KG1a和KG1a-DAC的IC50,以及地西他滨对KG1a和KG1a-DAC增殖能力和细胞活力的影响。

　　结果表明成功构建了KG1a-DAC(KG1a-DAC比KG1a对地西他滨的IC50>=10)。接着,本论文以KG1a和KG1a-DAC为实验对象,研究KG1a-DAC是否影响KG1a对地西他滨的敏感性。

　　主要实验结果如下:

　　(1)与KG1a-DAC共培养可以降低KG1a对地西他滨的敏感性。并且发现KG1a-DAC来源的条件培养基也可以降低KG1a对地西他滨的敏感性。

　　(2)用KG1a-DAC来源的sEVs处理KG1a后,实验结果表明KG1a-DAC来源的sEVs能显著降低KG1a对地西他滨的敏感性。

　　(3)共培养后的KG1a中地西他滨代谢相关蛋白ENT1,DCK,CDA蛋白没有显著变化,但是抑癌基因P15INK4B显著降低。用KG1a-DAC来源的sEVs处理KG1a,实验结果表明KG1a-DAC来源的sEVs能抑制地西他滨诱导KG1a中P15INK4B表达。且通过GW4869抑制sEVs的分泌阻碍了KG1a-DAC对KG1a的影响,进一步证明KG1a-DAC主要通过sEVs抑制KG1a中P15INK4B表达,减弱其对地西他滨的敏感性。

　　(4)通过miRDB,miRWalk,targetscan数据网站预测,以及RT-qPCR验证鉴定出KG1a-DAC来源的sEVs包含靶向P15INK4B基因的miR-323b-5p。通过向KG1a中瞬时转染miR-323b-5p inhibitor后与KG1a-DAC共培养,再检测KG1a中P15INK4B的表达,实验证明miR-323b-5P的靶基因是P15INK4B。

　　(5)向KG1a中瞬时转染miR-323b-5p inhibitor后与KG1a-DAC共培养,随后通过CCK8检测KG1a的活力,结果证明miR-323b-5p inhibitor能阻断共培养影响KG1a对药物的敏感性。

　　综上发现KG1a-DAC通过sEVs传递miR-323b-5p,从而抑制KG1a中P15INK4B的表达,以此降低KG1a对地西他滨的敏感性。