如何养好细胞之工具细胞培养及应用

　　工具细胞是实验或者生产中常用到的细胞株，是一类很常用的表达研究外源基因的细胞株。工具细胞通常培养条件简单，比较容易转染，应用于科研领域和工业生产。常用的工具细胞有以下几种：293细胞、CHO细胞、Vero细胞等。

　　一、293细胞

　　HEK293又称293细胞，是人胚肾293细胞。1973年，荷兰莱顿大学的Alex Van Der Eb博士和Frank Graham博士在研究人类腺病毒（Adenovirus）时培养了这种细胞，在第293次实验成功产生了原始细胞克隆，所以命名为293细胞。由于293细胞的19号染色体整合了大约4.35 kb的腺病毒基因组片段，使其细胞周期以及细胞表型、核型等发生了改变，获得永生化特性，在生产腺病毒载体和腺相关病毒载体、生产蛋白、疫苗、抗癌试剂以及细胞生物学研究上广泛应用。

　　到目前为止，根据不同的研究与生产需求，已经人为地建立了许多HEK293细胞的亚型和衍生细胞系，293T、293T/17、293A、AAV-293、293H、293S、293SG、293F、293FT、293FTM、293E、293-6E等，下面就来介绍这些细胞的培养及应用。

　　293细胞培养条件

　　形态：上皮细胞样

　　生长特性：贴壁

　　生长培养基：DMEM培养基90%；优质胎牛血清，10%。

　　培养条件：空气，95%；CO2，5%；37℃

　　冻存条件：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO。

　　传代比例：1:3-1:4，1周换液2-3次

　　注意事项：该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基

　　1.293T细胞

　　293T细胞由HEK293细胞衍生而来，是SV40 largeT抗原稳转得到的细胞株，和HEK293细胞一样容易转染，用磷酸钙、PEI或脂质体转染，效率均可达90%以上。其表达的SV40 largeT抗原可实现外源表达载体的扩增，最终增加目的基因的表达量。293T细胞常用于基因表达、蛋白生产慢病毒、逆转录病毒及腺病毒的包装等。

　　2.293T/17细胞

　　293T/17细胞株是293T（293tsA1609neo）细胞株的衍生株。293T细胞中共转染入pBND和pZAP质粒，获得的具有G418耐受的细胞系即为293T/17细胞系。293T/17细胞持续表达猿病毒40（SV40）大T抗原，因其高转染能力筛选到17号克隆。293T/17的转染效率更高，已经成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。

　　3.293A细胞

　　293A细胞是众多293细胞系列的一个亚克隆，因其具有相对扁平的形态和良好的贴壁能力而得名（A是adhesion首字母）。该细胞含有一个稳定整合的E1基因拷贝，能够提供生成重组腺病毒所需的E1蛋白（包括E1a和E1b蛋白），故它常被用于腺病毒的初始生产、扩增和滴定。在培养过程中，该细胞呈现单层的扁平形态，没有明显的细胞重叠和细胞空隙（hole），这使得病毒滴定和空斑测定（plaque assay）更为容易。

　　4.AAV-293细胞

　　AAV-293源自普遍使用的HEK293细胞株，但用它包装腺病毒相关重组病毒产生的滴度更高。HEK293细胞是剪切过的腺病毒5型DNA转染的人胚肾细胞。跟HEK293细胞一样，AAV-293细胞反式表达腺病毒E1基因，当共转染三个AAV助质粒（一个含ITR的质粒，pAAV-RC，和E1缺失助质粒）时，可以产生有感染力的腺相关病毒颗粒。更推荐用AAV-293来包装腺相关病毒。

　　5.293H细胞

　　293H细胞是将293细胞驯化后得到的能够在无血清培养体系下快速生长、具有高转染效率及高效蛋白表达性能的细胞系。另外，该细胞系贴附力好，常用于噬菌斑检测等应用。

　　6.293S细胞

　　293S细胞是被驯化成能够悬浮培养且能够耐受低钙离子培养条件的293细胞系。

　　7.293SG细胞

　　将293S细胞用甲基磺酸乙酯诱变处理，蓖麻毒素选择后再转染pcDNA6/TR质粒得到耐受蓖麻毒素的细胞系即为293SG。该细胞系缺乏乙酰氨基葡萄糖转移酶I活性，因此可促进蛋白的Man5GlcNAc2N-聚糖型糖基化修饰。此外，该细胞系中具有四环素表达抑制基因，可用于四环素诱导的蛋白表达研究。

　　293SG细胞系常用于同源的N-糖基化蛋白的表达。

　　8.293F细胞

　　293F细胞是一类能够在无血清中高表达蛋白的野生型293细胞系。

　　9.293FT细胞

　　293FT细胞是在293F细胞系中插入pCMVSPORT6TAg.Neo质粒的转化细胞系，能够快速增值，易转染，能够用于慢病毒载体的生产。

　　10.293FTM细胞

　　293FTM细胞则是来源于Flp-InTMT-RETM293细胞，该细胞系中转染了ecotropic receptor质粒及MAPPIT(mammalian protein-protein interaction trap)报告质粒，该细胞系主要用于蛋白互作的筛选。

　　11.293E细胞

　　293E细胞指的是在293-H细胞中插入EBNA-1基因的细胞系，该基因能够稳定表达EBV病毒的EBNA1蛋白。含有EBV复制起点（oriP）的重组表达质粒，能够在H293E细胞中复制，并实现蛋白的高效表达。

　　12.293-6E细胞

　　293-6E细胞则是在293-H细胞中插入截短过后的EBNA-1基因的细胞系，其能够在无血清培养基中高表达生产蛋白及病毒载体。

　　二、CHO细胞

　　CHO细胞于1956年从中国仓鼠卵巢细胞中分离出来，并被发现可以无限分裂的细胞，是成纤维细胞的一种。由于该细胞存在缺少脯氨酸合成基因的遗传缺陷，因此在培养过程中需在培养基中加入l-脯氨酸才能生长。

　　CHO细胞因为具有可粘附或悬浮生长、易基因突变、易基因转染、可实现蛋白翻译后修饰和化学选择等特点，被广泛认为是极佳的哺乳动物基因表达宿主细胞。CHO细胞隶属于成纤维细胞，内源性蛋白分泌少，因此非常有利于靶蛋白的分离和纯化。并且CHO细胞能够在无血清悬浮培养中以高密度生长，并且在延长的发酵周期中维持高水平的蛋白质表达。市场上超过70%的蛋白质药物的首选制造细胞都是CHO细胞，CHO细胞已经成为基因工程和生物制药的重要工具。

　　CHO细胞培养条件

　　形态：成纤维细胞样

　　生长特性：贴壁

　　生长培养基：DMEM＋10%FBS＋1%P/S

　　培养条件：空气，95%；CO2，5%；37℃

　　冻存条件：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO。

　　传代比例：1:3-1:4，1周换液2-3次

　　CHO细胞进一步分为野生型和突变型细胞两类。工业上最常见的几种细胞系包括CHO-k1、CHO-DG44、CHO-S等。

　　1.CHO-k1细胞

　　于1957年诞生，是早期CHO细胞的亚克隆，属于接近野生型细胞。但在1968年的突变分析表明，CHO-K1细胞缺乏甘氨酸生物合成的基因。CHO-K1细胞是实验中非常常用的一个细胞株，在生物制药中使用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。

　　2.CHO-DG44细胞

　　诞生于1983年CHO-DG44也属于DHFR缺陷细胞，与CHO-DXB11不同的是，CHO-DG44有一个DHFR双缺陷，有两个位点被敲除，因此DG44可用于筛分，在工业应用上最为广泛，目前市场上70%以上的抗体药都是由CHO-DG44宿主细胞表达。

　　3.CHO-S细胞

　　1973年Thompson实验室分离了一株可以悬浮培养的CHO细胞，命名为CHO-S，可在生物反应器中大规模培养。CHO-S细胞贴壁生长及悬浮生长均可。用于蛋白表达时，应使用悬浮生长状态，此时细胞生长状态更好，生物反应器中的传质、传热效率更高，同时也可提高生物反应器空间使用效率。工业上大规模生产单抗，重组蛋白，大部分使用悬浮培养法来生产。

　　三、Vero细胞

　　Vero细胞（又称非洲绿猴肾细胞）是一种非整倍性的非洲绿猴肾细胞系，最初由日本千叶大学的Yasumura和Kawakita于1962年3月分离自正常非洲成年绿猴的肾脏上皮细胞。其被广泛应用于病毒感染分子机制研究、疫苗及重组蛋白的生产。

　　vero细胞培养条件

　　形态：上皮细胞样

　　生长特性：贴壁

　　生长培养基：MEM＋10%FBS＋1%P/S

　　培养条件：空气，95%；CO2，5%；37℃

　　冻存条件：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO。

　　传代比例：1:2-1:3，1周换液2-3次

　　vero细胞应用

　　（1）用于检查大肠杆菌毒素。大肠杆菌毒素最初就因此细胞系而被命名为Vero毒素，后来被称为志贺菌素样毒素，因为它与在痢疾志贺菌中分离出来的志贺菌素很相似。

　　（2）作为培养病毒的细胞宿主。比如：测定某种药物对病毒复制速度的影响，检验是否存在狂犬病毒或者为了研究目的培养病毒。

　　（3）作为真核寄生虫的宿主细胞，尤其是锥体虫属。

　　（4）用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞，是在限定代次内不致癌的异倍体细胞，WHO批准可以用于人类疫苗的生产基质。

　　欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，官方网址：www.biobw.org，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！

　　北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。