引言
 
近年来抗体类治疗药市场正持续快速增长，其主要的应用领域是在与癌症、免疫（炎症）相关疾病的治疗领域。目前全球销售前10的药品中就有6种是单克隆抗体药物。预计该市场今后几年仍将继续增长，将有更多单克隆抗体（mAb）开发成新药用于治疗各种疾病。
 
在单抗药物的初期研发阶段，产生许多含有细胞培养物所分泌mAb的细胞上清液样品。这些样品需要筛选以测定mAb的滴度，这通常需要使用亲和Protein A色谱柱来完成。Protein A色谱柱还被用来测定从细胞培养物上清液中收集mAb的最佳时间以及筛选表达最大数量mAb的最佳细胞克隆物。此外，还可以先使用亲和Protein A色谱柱部分纯化mAb，以确定正确细胞系和部分表征新生成的mAb。由于要将许多样品筛选用于各种用途，所以需要一种可靠的、高通量的色谱柱。
 
在本文实验中，采用了TSKgel Protein A-5PW、20μm分析色谱柱用于快速捕获各种浓度的mAb并准确检测其滴度。这款规格为4.6mm I.D. ×3.5 cm 的PEEK色谱柱填充有键合重组Protein A配基（C区域的编码修饰六聚体）的聚甲基丙烯酸聚合物填料，可以在高流速下实现高通量分析，同时可保持色谱柱柱效、峰宽和分辨率。另外，TSKgel Protein A-5PW色谱柱可在进样2000多次后仍不会出现性能下降的情况。

1．实验条件
 

色谱柱：	TSKgel Protein A-5PW（20μm、4.6 mm I.D.× 3.5 cm（PEEK）） 其他品牌的Protein A色谱柱（20 μm、4.6 mmI.D. × 3.5 cm（PEEK））
结合缓冲液：	20mmol/L磷酸钠缓冲液、pH 7.4
洗脱液：	20mmol/L磷酸钠缓冲液、pH 2.5 （备注：还可以使用12 mmol/L的HCl、20-100mmol/L的柠檬酸、pH 2.5-3.5的20-100mmol/L甘氨酸、pH  2.5-3.5的5-10%醋酸洗脱IgG）
梯度洗脱：	0-0.5 min：结合缓冲液 0.5-1.1 min：洗脱缓冲液 1.1-2.0 min：结合缓冲液
流速：	2 mL/m
检测：	280nm UV
样品：	如色谱图所示的CHO上清液和IgG

2．结果与讨论
 
收集CHO细胞培养上清液后，将其短暂旋转去除细胞碎片并浓缩样品。然后使用Protein A色谱柱进行滴度分析。图1为TSKgel Protein A-5PW色谱柱快速捕获mAb（人IgG）的色谱图。在2分钟内完成分析，包括结合、洗涤、洗脱和再平衡步骤。色谱柱不吸附上清液中的宿主细胞蛋白，因此被洗脱为流穿峰。仅IgG被捕获，然后以约1分钟的洗脱时间从色谱柱中洗脱出。之后，使用TSKgel UP-SW3000尺寸排阻法色谱柱对IgG峰组分进行处理，对多聚体和单体进行分析。分析结果表明：收集的IgG中98%以上都为单体（数据未显示）。
 
图1. 使用TSKgel Protein A-5PW色谱柱快速捕获CHO细胞培养上清液中的IgG
 

测定所收集细胞培养上清液中的mAb浓度需要色谱柱在较宽的动态范围内都具有良好线性，从而准确检测mAb浓度。图2为具有良好线性（R² >0.999）的校准曲线，表明TSKgel Protein A-5PW色谱柱对多克隆IgG（0.1-10 g/L）具有较宽的动态范围。该色谱柱检测2～200 μg不同浓度样品获得的色谱图相似，其峰型和保留时间都无任何变化（见图3）。


 

色谱柱：	TSKgel Protein A-5PW（20μm、4.6mm I.D.× 3.5 cm）
结合缓冲液：	20mmol/L磷酸钠缓冲液、pH 7.4
洗脱液：	20mmol/L磷酸钠缓冲液、pH 2.5
梯度洗脱：	0-0.5 min：结合缓冲液 0.5-1.1 min：洗脱缓冲液 1.1-2.0 min：结合缓冲液
流速：	2 mL/min
检测：	280nm UV
样品：	含有多克隆IgG（0.5 mg/mL）的20μL CHO细胞培养上清液

图2和3 TSKgel Protein A-5PW色谱柱在宽范围载量下与峰面积呈良好线性关系



图4中对TSKgel Protein A-5PW色谱柱进行了线性分析测试，表明了该色谱柱的耐用性和其较宽的动态载量范围。
取用含IgG单克隆抗体的CHO细胞培养上清液作为样品，连续2009次进样而不清洗色谱柱。最后，采用市售IgG单克隆抗体制作校准曲线时，测试前后IgG校准曲线未发现有明显变化。色谱柱仍然保持其高载能力及优异的线性关系（R²=0.9999）。
 
图4. TSKgel Protein A-5PW色谱柱的耐用性和动态范围



通过四种不同流速（1、2、3和4 mL/min）证明TSKgel Protein A-5PW色谱柱对分离效果的影响。图5表明：流速对色谱柱结合与吸收IgG的影响极小。不同流速时的未结合（流穿）蛋白峰与结合IgG的相对峰面积百分比保持不变。
 
图5. 不同流速下TSKgel Protein A-5PW色谱柱分离IgG的色谱图


梯度条件

流速 （mL/min）	结合缓冲液 （min）	洗脱缓冲液 （min）	结合缓冲液 （min）
4.0	0-0.25	0.25-0.55	0.55-1.00
3.0	0-0.33	0.33-0.73	0.73-1.33
2.0	0-0.50	0.50-1.10	1.10-2.00
1.0	0-1.00	1.00-2.20	2.20-4.00

含有多克隆抗体（0.5 mg/mL）的20 μLCHO细胞培养上清液

3．结论
 
TSKgel Protein A-5PW亲和色谱柱可在2分钟内捕获和准确定量所收集细胞培养基中的单克隆抗体。此款色谱柱因其耐受高流速和耐用性的特点，可以实现高通量分析。并且具有较宽的动态范围，适用于检测不同工艺阶段的mAb滴度。