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上海瑞楚生物科技有限公司
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技术资料/正文
细胞一般建议培养方法
372 人阅读发布时间：2022-03-16 23:09
使用说明：（以下使用说明为常规操作方法，特殊细胞特殊操作除外）
1.1 拿到细胞后操作
（1）如果细胞为贴壁细胞，而收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞即时离心，加25%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为25%血清的完全培养基培养3天。3天后若原瓶或者新瓶中的细胞都没有出现增值而是继续脱落死亡，请及时联系实验室技术人员会跟进解决；
（2）贴壁细胞生长缓慢；适当提高血清浓度(最高不能超过20%)，或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养；
（3）生长不均：贴壁细胞若出现分布不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重悬打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。
1.2 贴壁胞常规传代流程：
（1）吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2~3 ml 含0.25% EDTA的胰酶进行消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）；
（2）镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小时去掉胰酶，加6~8 ml 完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散；
（3）取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养；首次传代，建议 1:2 传代。
（4）注意培养基PH值变化情况，定期换液，待转化细胞密度达到70-80%以后重复传代操作或者冻存。
1.3悬浮细胞常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）
（1）悬浮细胞常规传代操作为半量换液，分瓶传代，即取出一半细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养；也可根据细胞密度分多瓶传代。
（2）注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。
1.4半贴壁半悬浮细胞培养注意事项（请严格遵守无菌操作）
（1）若悬浮细胞较多且折光率良好，可离心收集，继续培养。
（2）若有少量细胞悬浮，也可不用收集，传代操作按常规贴壁细胞操作流程处理。
（3）若悬浮细胞较多，离心收集，原瓶中贴壁细胞按照常规规贴壁细胞操作流程进行消化、终止消化、吹打，并与之前收集的悬浮细胞混悬，分瓶培养。
2 细胞冻存基本方法：
（1）细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。
（2）计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5*106/ml，离心去上清，吸入离心管中。
（3）冻存液：先用培养液9份＋DMSO 1份配成10%的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
（4）分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。
（5）封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。
3 细胞运输说明：
细胞长到70%左右，用完全培养基灌满培养瓶并密封，包装严实后，通过快递运输，理论上常温运输即可。
1.1 拿到细胞后操作
（1）如果细胞为贴壁细胞，而收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞即时离心，加25%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为25%血清的完全培养基培养3天。3天后若原瓶或者新瓶中的细胞都没有出现增值而是继续脱落死亡，请及时联系实验室技术人员会跟进解决；
（2）贴壁细胞生长缓慢；适当提高血清浓度(最高不能超过20%)，或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养；
（3）生长不均：贴壁细胞若出现分布不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重悬打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。
1.2 贴壁胞常规传代流程：
（1）吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2~3 ml 含0.25% EDTA的胰酶进行消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）；
（2）镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小时去掉胰酶，加6~8 ml 完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散；
（3）取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养；首次传代，建议 1:2 传代。
（4）注意培养基PH值变化情况，定期换液，待转化细胞密度达到70-80%以后重复传代操作或者冻存。
1.3悬浮细胞常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）
（1）悬浮细胞常规传代操作为半量换液，分瓶传代，即取出一半细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养；也可根据细胞密度分多瓶传代。
（2）注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。
1.4半贴壁半悬浮细胞培养注意事项（请严格遵守无菌操作）
（1）若悬浮细胞较多且折光率良好，可离心收集，继续培养。
（2）若有少量细胞悬浮，也可不用收集，传代操作按常规贴壁细胞操作流程处理。
（3）若悬浮细胞较多，离心收集，原瓶中贴壁细胞按照常规规贴壁细胞操作流程进行消化、终止消化、吹打，并与之前收集的悬浮细胞混悬，分瓶培养。
2 细胞冻存基本方法：
（1）细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。
（2）计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5*106/ml，离心去上清，吸入离心管中。
（3）冻存液：先用培养液9份＋DMSO 1份配成10%的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
（4）分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。
（5）封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。
3 细胞运输说明：
细胞长到70%左右，用完全培养基灌满培养瓶并密封，包装严实后，通过快递运输，理论上常温运输即可。