流式细胞术中，抗体的非特异性结合是影响实验精度的重要问题，特别是由于Fc受体（FcR, Fragment Crystallizable Receptor）的存在。抗体由Fab段和Fc段组成，其中Fab段负责与目标分子特异性结合，而Fc段则与效应分子或细胞相互作用（见Fig 1）。FcR是免疫调节系统中的重要受体，主要表达在先天免疫细胞（Innate Immune Cells）表面，如巨噬细胞（Macrophages）、单核细胞（Monocytes）、中性粒细胞（Neutrophils）、树突状细胞（Dendritic Cells）等。FcR能够识别并结合抗体的Fc段，从而引发免疫应答。在实验中，这种识别可能导致抗体的Fc段与细胞表面的FcR发生非特异性结合，进而产生背景噪音，甚至是假阳性信号。

 

 

Fig 1.Diagram showing the interaction of IgG with various receptors

准确区分阳性和阴性细胞在细胞实验中至关重要。尽管阳性细胞依赖于抗体的特异性结合，但大多数免疫细胞（如巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）表面均表达FcR，并与抗体的Fc段有不同程度的亲和力。这意味着抗体的Fc段可能与这些细胞表面的FcR发生非特异性结合，导致流式细胞图中出现本不应存在的非特异性细胞群。因此，尤其是在涉及抗原-抗体反应的实验中，使用FcR阻断剂（FcR Blocking Reagents）尤为重要，以确保实验的特异性.

Fig 2. MFI values of CD14⁺ monocytes stained with IgG antibodies under different Fc blocking conditions, showing reduced non-specific binding with various blocking reagents.

研究表明，常用的同型对照并不能有效扣除这种非特异性结合的信号，反而可能导致背景增高甚至是假阳性结果。因此，建议在实验中添加FcR阻断剂，以减少这种非特异性反应。Anderson等人在2016年的研究中发现，小鼠IgG1和IgG2a抗体与人类单核细胞和巨噬细胞结合时表现出明显的非特异性结合，而B细胞（B Cells）、T细胞（T Cells）和NK细胞（Natural Killer Cells）则没有这种现象。研究还指出，常用的同型对照在消除这种非特异性结合时并不可靠，建议使用FcR阻断剂来提高实验的准确性。

Fig 3. Isotype control binding cells are exclusively monocytes. 

FcR根据其结合的免疫球蛋白（Ig）的类型分为五类：IgG（FcγR）、IgE（FcεR）、IgA（FcαR）、IgM（FcμR）和IgD（FcδR）。其中，IgG类型的Fc受体根据其与Fc段的亲和力可进一步分为三个亚家族：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16），每个亚家族还有多个亚类（见图4）。这些FcR主要表达在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和NK细胞表面，尤以B细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的表达最为显著。

Fig 4. Schematic diagram of the main types of Fcγ receptors and their distribution across different cell types.

对于FcR高表达或具有高Fc段亲和力的细胞类型，如髓系细胞（Myeloid Cells）系，建议在实验中使用FcR阻断剂，以减少非特异性反应。此外，在检测或分析低表达水平的表面抗原时，或者在处理复杂样本时，使用FcR阻断剂有助于提高检测的特异性。通过使用Fc阻断剂，能够显著减少流式细胞术中的假阳性信号，降低背景干扰，从而获得更清晰、可靠的实验结果。

总结来说，无论是为了在流式细胞术中区分阳性和阴性细胞，还是为了减少非特异性反应，使用FcR阻断剂都是确保实验精度的关键步骤。对于那些FcR表达较高的细胞类型，尤其是髓系细胞，使用FcR阻断剂可以大大提高实验数据的可靠性和准确性。

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参考文献：

[1]Andersen, Morten N et al. “Elimination of erroneous results in flow cytometry caused by antibody binding to Fc receptors on human monocytes and macrophages.” Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology vol. 89,11 (2016): 1001-1009. doi:10.1002/cyto.a.22995

 

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