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上海达为科生物科技有限公司
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入驻年限：6 年
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张经理
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上海 宝山区
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细胞库 / 细胞培养、论文服务、试剂、实验室仪器 / 设备、技术服务、医疗器械、耗材
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生产厂商 经销商 代理商 科研机构
技术资料/正文
免疫组化（IHC）操作规程
1288 人阅读发布时间：2021-03-29 10:29
免疫组化操作规程
（一）仪器设备
（1）18cm 不锈钢高压锅和电炉；（2）医用微波炉；（3）水浴箱；（4）冰箱（-18℃ -4℃）；（5）湿盒；（6）耐高温塑料切片架；（7）可调微量移液器；（8）定时器；（9）pH计。
（二）试剂
（1）PBS（磷酸盐缓冲液 pH7.2-7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L， Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
（2）柠檬酸盐缓冲液 （CB pH6.0 0.01mol/L 1000ml 配制）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
（3）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8）配制； b、0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N 的HCl配制。
（三）操作流程
1 脱蜡和水化
脱蜡前 将组织芯片放在 60 恒温箱中烘烤 30 分钟。
（1）置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中再浸泡10分钟；
（2）无水乙醇I中浸泡5分钟，在无水乙醇II中再浸泡5分钟；
（3）95%乙醇中浸泡5分钟；
（4）85%乙醇中浸泡5分钟；
（5）70%乙醇中浸泡5分钟；
（6）蒸馏水中浸泡5分钟。
2 抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
（1）抗原热修复
A 高温高压热修复
取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）于压力锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时1-2 分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟。
B 微波热修复
取一定量的0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）于微波盒中，微波加热至沸腾， 将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档继续处理10-15分钟，取出微波盒冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用 PBS 洗5分钟。
C 酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液，胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37摄氏度时间为 10-30 分钟。
3 免疫组织化学染色
SP 法
（1）脱蜡、水化；
（2）蒸馏水中5分钟；
（3）用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10分钟，蒸馏水洗 1 次；
（4）抗原修复；
（5）PBS 洗5分钟；
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温 10 分钟；
（7）甩去多余液体，滴加I抗， 37℃1小时或者4℃过夜（4℃过夜后在37℃复温45分钟）；
（8）PBS洗2次各5分钟；
（9）滴加生物素化II抗；（孵育条件参见所用试剂盒）
（10）PBS 洗2次各5分钟 ；
（11）滴加酶标抗体；（孵育条件参见所用试剂盒）
（12）PBS 洗2次各5分钟；
（13）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度 ；
（14）蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；
（15）脱水、透明、封片、镜检。
SABC 法
（1）脱蜡、水化；
（2）蒸馏水中5分钟；
（3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，蒸馏水洗 1 次；
（4）抗原修复；
（5）PBS洗5分钟；
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温10-20分钟，甩去多余液体；
（7）滴加I抗，37℃1小时或者4℃过夜；（4℃过夜后在37℃复温30分钟）
（8）PBS洗2次每次5分钟；
（9）滴加生物素化二抗；（孵育条件参见所用试剂盒）
（10）PBC洗2次每次5分钟；
（11）滴加试剂SABC；（孵育条件参见所用试剂盒）
（12）PBS洗2次，每次5分钟；
（13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色；（镜下掌握显色程度）
（14）蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；
（15）脱水、透明、封片、镜检。
（1）18cm 不锈钢高压锅和电炉；（2）医用微波炉；（3）水浴箱；（4）冰箱（-18℃ -4℃）；（5）湿盒；（6）耐高温塑料切片架；（7）可调微量移液器；（8）定时器；（9）pH计。
（二）试剂
（1）PBS（磷酸盐缓冲液 pH7.2-7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L， Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
（2）柠檬酸盐缓冲液 （CB pH6.0 0.01mol/L 1000ml 配制）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
（3）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8）配制； b、0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N 的HCl配制。
（三）操作流程
1 脱蜡和水化
脱蜡前 将组织芯片放在 60 恒温箱中烘烤 30 分钟。
（1）置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中再浸泡10分钟；
（2）无水乙醇I中浸泡5分钟，在无水乙醇II中再浸泡5分钟；
（3）95%乙醇中浸泡5分钟；
（4）85%乙醇中浸泡5分钟；
（5）70%乙醇中浸泡5分钟；
（6）蒸馏水中浸泡5分钟。
2 抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
（1）抗原热修复
A 高温高压热修复
取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）于压力锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时1-2 分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟。
B 微波热修复
取一定量的0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）于微波盒中，微波加热至沸腾， 将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档继续处理10-15分钟，取出微波盒冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用 PBS 洗5分钟。
C 酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液，胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37摄氏度时间为 10-30 分钟。
3 免疫组织化学染色
SP 法
（1）脱蜡、水化；
（2）蒸馏水中5分钟；
（3）用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10分钟，蒸馏水洗 1 次；
（4）抗原修复；
（5）PBS 洗5分钟；
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温 10 分钟；
（7）甩去多余液体，滴加I抗， 37℃1小时或者4℃过夜（4℃过夜后在37℃复温45分钟）；
（8）PBS洗2次各5分钟；
（9）滴加生物素化II抗；（孵育条件参见所用试剂盒）
（10）PBS 洗2次各5分钟 ；
（11）滴加酶标抗体；（孵育条件参见所用试剂盒）
（12）PBS 洗2次各5分钟；
（13）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度 ；
（14）蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；
（15）脱水、透明、封片、镜检。
SABC 法
（1）脱蜡、水化；
（2）蒸馏水中5分钟；
（3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，蒸馏水洗 1 次；
（4）抗原修复；
（5）PBS洗5分钟；
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温10-20分钟，甩去多余液体；
（7）滴加I抗，37℃1小时或者4℃过夜；（4℃过夜后在37℃复温30分钟）
（8）PBS洗2次每次5分钟；
（9）滴加生物素化二抗；（孵育条件参见所用试剂盒）
（10）PBC洗2次每次5分钟；
（11）滴加试剂SABC；（孵育条件参见所用试剂盒）
（12）PBS洗2次，每次5分钟；
（13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色；（镜下掌握显色程度）
（14）蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；
（15）脱水、透明、封片、镜检。