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上海达为科生物科技有限公司
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上海达为科生物科技有限公司
入驻年限：6 年
- 联系人：
张经理
- 所在地区：
上海 宝山区
- 业务范围：
细胞库 / 细胞培养、论文服务、试剂、实验室仪器 / 设备、技术服务、医疗器械、耗材
- 经营模式：
生产厂商 经销商 代理商 科研机构
技术资料/正文
组织WB实验完整步骤
1613 人阅读发布时间：2021-03-03 13:25
SDS-PAGE电泳
1．制备分离胶(pH 8.8)：
凝胶浓度 10%
30: 0.8% w/v丙烯酰胺：双丙烯酰胺 2.5ml
1.0M Tris-Cl pH 8.8 3ml
20% SDS 38ul
dH2O 1.9ml
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 36ul
TEMED 5ul
总体积 l 7.5ml
用注射器将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6厘米左右，预留1.5cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上覆盖0.1% SDS，放置1小时左右至聚合完全。
2．制备积层胶(pH 6.8)：
4%积层胶配合<10% 的分离胶使用，6%积层胶配合>10%的分离胶使用。
积层胶浓度 4%
30:0.8% w/v 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 660 ul
1M Tris-Cl pH6.8 630 ul
20% SDS 25 ul
dH2O 3.6 ml
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 25ul
TEMED 5ul
总体积 5ml 5ml
使用Whatman 3mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。
3．样品准备：
上样染液 (Laemmli上样染液) 3X 储存液
1M Tris-Cl pH 6.8 2.4 ml
20% SDS 3 ml
甘油(100%) 3 ml
β巯基乙醇 1.6 ml
溴酚蓝 0.006g
总体积 10 ml (储存于4°C)
准备1X 上样缓冲液的样品液：如6 ul蛋白样品加入3 ul 3X 上样染液储存液。每孔配制含50ug总蛋白样的样品液。上样前煮沸3分钟。
4．加入电泳缓冲液，上样：
凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1到2cm。BioRad电泳槽中需加入500 ml的1X 电泳缓冲液(50 ml的10X储存液+ 450 ml dH20)。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中。
5．电泳：使用BioRad电泳装置，样品首先在20 mA恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后60mA恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4℃。
1．制备分离胶(pH 8.8)：
凝胶浓度 10%
30: 0.8% w/v丙烯酰胺：双丙烯酰胺 2.5ml
1.0M Tris-Cl pH 8.8 3ml
20% SDS 38ul
dH2O 1.9ml
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 36ul
TEMED 5ul
总体积 l 7.5ml
用注射器将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6厘米左右，预留1.5cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上覆盖0.1% SDS，放置1小时左右至聚合完全。
2．制备积层胶(pH 6.8)：
4%积层胶配合<10% 的分离胶使用，6%积层胶配合>10%的分离胶使用。
积层胶浓度 4%
30:0.8% w/v 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 660 ul
1M Tris-Cl pH6.8 630 ul
20% SDS 25 ul
dH2O 3.6 ml
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 25ul
TEMED 5ul
总体积 5ml 5ml
使用Whatman 3mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。
3．样品准备：
上样染液 (Laemmli上样染液) 3X 储存液
1M Tris-Cl pH 6.8 2.4 ml
20% SDS 3 ml
甘油(100%) 3 ml
β巯基乙醇 1.6 ml
溴酚蓝 0.006g
总体积 10 ml (储存于4°C)
准备1X 上样缓冲液的样品液：如6 ul蛋白样品加入3 ul 3X 上样染液储存液。每孔配制含50ug总蛋白样的样品液。上样前煮沸3分钟。
4．加入电泳缓冲液，上样：
凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1到2cm。BioRad电泳槽中需加入500 ml的1X 电泳缓冲液(50 ml的10X储存液+ 450 ml dH20)。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中。
5．电泳：使用BioRad电泳装置，样品首先在20 mA恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后60mA恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4℃。