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流式调补偿,知多少?

人阅读 发布时间:2020-04-08 17:36

小伙伴们做流式时通常会遇到调补偿的问题,为啥调补偿,不调补偿怎么样,怎么调补偿?小E哥在这里与大家一起分享自个儿关于调补偿的经历!
 

▲调节补偿,Why?

图1分别为FITC、PE、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7 的发射光谱,其发射光谱范围一般在 100-200nm 之间,如同时用 488nm 的激光器去激发,虽然每个染料都有对应它最大发射波长的滤光片来接收荧光信号,但如果染料的发射光谱较宽,该染料的发射光就会被不止一个通道接收。
 

以图中的 PE 染料为例,PE 通道接收的信号除了 PE 外还有 FITC、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7。为了我们检测的是单独的 PE 信号,就需要设置单染管进行荧光补偿的调节,进而去除其他荧光的干扰。
 

图1  FITC、PE、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7 的发射光谱

 

图2 将 FITC、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7 的荧光从 PE 通道中去除的模式图
 

▲如何调节补偿,How?
 

①不加药处理的阴性细胞调节 FFC、SSC 电压,加药处理的只加一种染料的阳性细胞调节该通道的电压。
②加药处理的只加一种染料的阳性细胞调节补偿。
③补偿调节好后,用加药处理过的双染管上流式。

 

以调节 FITC 和 PE 之间的补偿值为例如下表进行设置:

样品序号

标记方法

目的

1

空白

阴性对照

2

标记 FITC

去除 PE 通道中的 FITC 信号

3

标记 PE

去除 FITC 通道中的 PE 信号

4

同时标记 FITC 和 PE

观察补偿后的调节效果


FITC 单染管:FITC 荧光渗漏到 PE 通道,我们需要设置 FITC 单染管,将渗漏进 PE 通道的 FITC 荧光信号去除,也就是得出 PE-FITC 补偿值。
PE 单染管:PE 荧光渗漏到 FITC 通道,我们需要设置 PE 单染管,将渗漏进 FITC 通道的 PE 荧光信号去除,也就是得出 FITC-PE 补偿值。
 

▲不设置补偿调节对结果有什么影响,If not?
 

有小伙伴觉得设置荧光补偿麻烦,哼,干脆不设置了,那我们就一起来看下补偿前和补偿后的流式结果吧。

如图 3-A 列所示是荧光补偿调节之前的流式结果,分别是 FITC 单染管、PE 单染管、双染管的流式图,图 3-B 列所示是荧光补偿调节过度的流式结果,图 3-C 是补偿调节不够的流式结果,图 3-D 是荧光补偿正确的流式结果。

没有设置补偿调节组各个象限细胞比例与设置补偿正确组相差大,且分群不美观,而补偿调节不够或过度也会引起象限内细胞比例产生偏差,且分群不美观。

 补偿对结果的影响 
 

 

▲哪些因素会影响补偿的调节?Which?
 

电压电压变荧光补偿变,我们需要先调节 FSC、SSC 电压和荧光通道的电压然后调节补偿值。

荧光染料本身的光谱特性和荧光强度先根据流式细胞仪的配制,包括激光器、光路设计以及滤光片等,确定有哪些染料可用,后选择发射光谱重叠较小的荧光染料。

如图:我们可以看到APC和7-AAD有很大一部分的重合,PE和7-AAD的重叠区域就比较小,我们选择染料时,最好是选择光谱重叠较少的一起连用。


如图:YF488和PI光谱重叠区域较少,两种染料,适合同时使用。

细胞当细胞的理化性质相差较大时,流式结果可能不尽相同。如标记相同的荧光素偶联抗体,使用相同的通道,但样品细胞分别是活细胞与固定后细胞时,得到的流式结果可能就不一样。所以当细胞理化性质差异较大时,最好重新调节新的样品细胞的补偿,确保获得准确的流式结果。

 

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