低丰度靶标染色神器——TSA 与 PSA

今天，百萤为大家带来的是用于细胞和组织中低丰度靶标的高分辨率成像技术。TSA/PSA 是一种成熟的细胞信号放大技术，当 TSA/PSA 与我们光稳定性、水溶性卓越的 iFluor 染料结合后，产生的荧光信号具有比传统免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫荧光方法产生的信号更高的精确度和灵敏度。PSA 是美国 AAT Bioquest 自主研发的与 TSA 功能类似的信号放大方法，其荧光信号强度比广泛使用的 tyramide（TSA）试剂高 10-50 倍。感兴趣的朋友一起来看看吧！

TSA/PSA 原理

酪胺信号放大（TSA）是一种基于辣根过氧化酶（HRP）的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。原理为酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应（已标记荧光的酪胺在 HRP 催化 H₂O₂下形成共价键结合位点）产生的大量酶促产物与目标蛋白的酪氨酸残基共价结合，从而使目标蛋白标记上特异的荧光或生物素。

图 1.TSA/PSA 原理及工作流程图。通过类似于传统 ICC 和 IHC 方法的工作流程，TSA/PSA 试剂可以通过几个简单的步骤实现对所需目标的灵敏检测。

表 1.TSA/PSA 技术与传统免疫荧光对比

	TSA/PSA多标免疫荧光	传统免疫荧光
靶点数目	不受限制（最多可同时染色 7-10 种）	一般标记 3 种（含 DAPI）,>3 种标记难度较大
一抗种类	同一种属的不同抗体即可满足要求	不同种属的不同抗体
二抗种类	连接辣根过氧化物酶的同种属二抗	连接荧光探针的不同种属二抗
染色策略	任何样本无需任何染色策略，简单的重复前一步的染色过程，样本/靶点的差异不影响染色过程，使用简单方便	样本抗原的空间位置的差异，需要设计复杂的染色策略。样本/靶点的差异导致染色策略的差异，染色过程复杂、多变
染色效果	高染色分辨率和染色特异性，信号强度更强,更稳定,淬灭时间更长，无背景影响，各靶点的信噪比大大提高，尤其适合组织基于单细胞的定量分析	亮度较弱,容易淬灭,各种抗体间存在互相影响，背景较高，对基于单细胞的定量分析不利。
实验成本	同一种属的一抗和二抗，价格相对便宜。简单的染色策略和无需任何重复的预实验，即可掌握整个染色技术，大大缩小了预实验的材料损耗。一抗和二抗工作浓度更低,单次费用更低	不同种属的抗体价格存在差异，一般种属稀少的价格高。不同种属的二抗，价格存在差异，一般稀少的种属价格高。寻找合适的染色策略，复杂的多次重复的预实验大大的增加了实验成本
应用范围	二抗具备通用性，因此实验室中所有的研究领域均可使用	二抗不具备通用性，实验室中应用领域受到局限

TSA/PSA 特点

TSA

PSA

1. 适用广，多色标记

2. 多重标记可避免抗体种属交叉问题

3. 染色特异性好，信号强度高，适合低丰度靶标

4. 石蜡切片样本荧光染色背景干净

1. 检测灵敏度提高了 100 多倍，比标准 IHC，ICC，IF 方法高出 100 倍

2. 改进的荧光信号比酪胺（TSA）试剂高 10 至 50 倍

3. PSA 自由基的更高反应性允许在 HRP- 靶相互作用位点更快速，有效和更稳定地标记 Styramide 缀合物

4. 在不牺牲灵敏度的情况下，PSA 可以使用更少量的抗体/探针

实验结果展示

图 2. 分别用 iFluor 488 PSA 和 Alexa Fluor 488 TSA 染色甲醛固定的石蜡包埋人肺腺癌阳性组织的染色结果图。人肺腺癌阳性组织切片用兔抗 EpCam 抗体染色，然后用 polyHRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗孵育，最后使用 iFluor 488 PSA（Cat#45020）和 Alexa Fluor 488 TSA 分别染色。图像显示 iFluor 488 PSA 与 Alexa Fluor 488 TSA 相比提高了荧光 IHC 的灵敏度。

图 3. 分别用 iFluor 488 酪胺和 Alexa Fluor 488 酪胺染色甲醛固定的石蜡包埋人肺腺癌阳性组织的染色结果图。人肺腺癌阳性组织切片用兔抗 EpCam 抗体染色，然后用 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗孵育。显影：iFluor 488 酪胺（左）；Alexa Fluor 488 酪胺（右）。核染色：DAPI

图 4. Styramide 超级信号放大试剂盒的信号强度对比。（A）将 HeLa 细胞固定，透化并用各种浓度的兔抗微管蛋白一抗标记，建议的稀释浓度为：1：500。然后将细胞直接与 AlexaFluor488 缀合的山羊抗兔 IgG 二抗染色，最后分别与 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗、AlexaFluor 488 酪胺和 iFluor 488 Styramide（#45205）染色。使用 FITC 滤光片组拍摄荧光图像，并以相同的曝光时间进行分析。（B）测量相对荧光信号强度，并比较不同检测方法之间的强度。

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分类	货号	产品名称	Ex(nm)	Em(nm)
TSA 试剂	45100	iFluor 488 酪胺	491	514
	45105	iFluor 555 酪胺	552	567
	45110	iFluor 647 酪胺	649	665
	11070	AF488 酪胺	491	518
	11075	AF546 酪胺	554	570
	11082	AF594 酪胺	590	617
	11065	Cy3 酪胺	555	565
	11066	Cy5 酪胺	644	665
	11061	Azido-Cy5 酪胺	644	665
PSA 试剂	45000	iFluor 350 Styramide	345	442
	45020	iFluor 488 Styramide	491	514
	45025	iFluor 546 Styramide	541	557
	45027	iFluor 555 Styramide	552	567
	45030	iFluor 568 Styramide	568	587
	45035	iFluor 594 Styramide	592	619
	45045	iFluor 647 Styramide	649	665
	45050	iFluor 680 Styramide	676	695
	45055	iFluor 700 Styramide	685	710
	45065	iFluor 750 Styramide	749	775
	45070	iFluor 790 Styramide	782	811
试剂盒	45200	iFluor 350 Styramide 超级信号放大成像试剂盒，含羊抗兔 IgG	345	442
	45205	iFluor 488 Styramide 超级信号放大成像试剂盒，含羊抗兔 IgG	491	514
	45220	iFluor 555 Styramide 超级信号放大成像试剂盒，含羊抗兔 IgG	552	567
	45230	iFluor 594 Styramide 超级信号放大成像试剂盒，含羊抗兔 IgG	592	619
	45240	iFluor 647 Styramide 超级信号放大成像试剂盒，含羊抗兔 IgG	649	665