青岛捷世康生物科技有限公司
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- 联系人：
王经理
- 所在地区：
山东 青岛市 市北区
- 业务范围：
试剂、耗材、实验室仪器 / 设备、书籍 / 软件、细胞库 / 细胞培养、技术服务、原辅料包材、抗体、ELISA 试剂盒
- 经营模式：
生产厂商 科研机构 代理商 经销商
公司新闻/正文
NADP-苹果酸酶（Malic enzyme，NADP-ME）试剂盒说明书
人阅读 发布时间：2023-11-20 15:13
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2 ，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NADP-ME催化NADP+还原成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。；
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 检测工作液的配制：用时在试剂三中加入15mL试剂一和5.5mL试剂二和1mL蒸馏水，充分混匀待用；现配现用。
3、测定前将检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min 以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和215μL工作液，混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1和1min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：如果 ΔA＜0.005，可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。
NADP-ME 活性计算：
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
= 3617×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T =3617×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/104cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T =7.234×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.25×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T
= 7234×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T =7234×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反总÷ （ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T =14.468×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.25×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
测定意义：
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2 ，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NADP-ME催化NADP+还原成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。；
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 检测工作液的配制：用时在试剂三中加入15mL试剂一和5.5mL试剂二和1mL蒸馏水，充分混匀待用；现配现用。
3、测定前将检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min 以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和215μL工作液，混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1和1min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：如果 ΔA＜0.005，可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。
NADP-ME 活性计算：
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
= 3617×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T =3617×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/104cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T =7.234×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.25×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T
= 7234×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T =7234×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-ME（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反总÷ （ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T =14.468×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.25×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
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