中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性测定试剂盒说明书
可见分光光度法        规格：50管/24样
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
NP在一定的温度和中性 pH 条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。
测定原理：
中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mLEP管和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 10 mL 试剂一，沸水溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加 50 mL 蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体×1 支，0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，
加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培养液：直接测定。
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温 30min。
3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入 1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为 A 对照管。
4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入 1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸
收，记为 A 测定管。 （注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5.空白管：取EP管，加入200μL 蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A空白管。
6.标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式：
1. 按照样本蛋白浓度计算
NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol 酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）
×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T= 625×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr
C标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反应时间（min），10min。
2．按照样本质量计算
NP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
NP活性（nmol/min/g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀
释倍数÷（W×V1÷V2）÷T= 625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
C 标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。
3. 按照液体体积计算
NP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol 酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷V1÷T= 625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）
C 标准品：0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中血清或培养液体积，100μL=0.1 mL；T：催化反应时间，10min。
4. 按照细胞数量计算
NP活性单位定义：30℃每10⁴个细胞每分钟催化水解产生1nmo 酪氨酸为1个酶活单位。
NP 活性（nmol/min /10⁴cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 625×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量
C 标准品：0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5； V1：加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1 mL；V2：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，
10min。
注意事项：
临用前配制的试剂配制好后 4℃保存，并且3天内使用完毕。