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免疫磁性分选技术在循环肿瘤细胞检测中的应用研究
发布时间：2022-05-10 14:26 | 点击次数：
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北京北加美瑞生物技术有限公司 李金燕
中国科学院遗传与发育生物学研究所 付仲华
北京北加美瑞生物技术有限公司 李金燕
中国科学院遗传与发育生物学研究所 付仲华
摘要：本文主要论述免疫磁性分选技术结合其他检测技术进行循环肿瘤细胞的检测。循环肿瘤细胞在早期发现转移性结直肠癌，乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤的微转移、监测术后复发与转移、评估疗效与预后、选择合适的个体化治疗等方面具有重要的作用。
恶性肿瘤严重威胁人类健康，其致死的主要原因是部分肿瘤细胞获得侵袭能力并造成远处转移 [1] 。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发病灶，以极少的数量转移到血液、骨髓、淋巴结或远处器官中，使用常规的检测手段难以发现，称为肿瘤的微转移 (M icrometas- tasis) 肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移病灶提供了可能，因此在外周血中检测循环肿瘤细胞 ( circu- lating tumor cells, CTC) 具有重要的临床应用价值。
目前的肿瘤转移理论认为，肿瘤细胞需要先从原发灶脱离并进入血液或淋巴循环，才能在远处形成转移灶 [2] 。因此，理论上 CTC 与肿瘤的血行转移有直接关系。深入研究 CTC 有助于对肿瘤转移机制的进一步了解，为抗肿瘤转移的治疗提供新的依据。CTC 的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略。
但是，对于 CTC 的检测和分析却并不容易，因为 CTC 并没有显著的特异性同其它血细胞明确区分；而且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物；此外，CTC 在外周血中数量稀少，一般在 106 ~ 107 个白细胞中仅含有 1 个。目前广大肿瘤研究人员特别关注的是如何找到 CTC 的特异性标志物并提高检测手段的敏感性和特异性。一般而言，CTC 检测的方法大致可以分为细胞计数和基于核酸的技术，通常都包括富集和检测两个步骤。因为 CTC 在外周血中数量稀少，富集细胞以提高检测的敏感性是有必要的。其中一种富集的方法则是根据形态学标准，包括细胞的大小、密度等等，而另一种方法则是根据目的细胞上带有可用于免疫学分离的特异性标志物。细胞富集结束后，基于核酸的技术或细胞计数方法通过公认的肿瘤特异性标志物对 CTC 进行检测和分析。本文也将介绍一种外周血循环肿瘤细胞富集的新方法。
1．免疫磁性分选技术原理
免疫磁珠是均匀、球形具有超顺磁性及保护壳的微粒。其基本原理是，磁珠既能结合活性蛋白质 ( 抗体)，又能被磁铁所吸引，经过一定处理后，可将特异性单克隆抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体。磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物。把这种复合物放入磁场中，复合物就会因磁力作用而发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性成分的目的。此种分离技术将抗原抗体反应的高度特异性和磁珠的富集分离作用相结合，达到特异性的生物活性物质和细胞的富集和分离效果，使其在临床医学诊断上具有广阔的应用前景 [3]。
2．结合免疫磁性分选技术的检测方法
2.1 免疫磁珠+ 免疫细胞化学法
将免疫磁珠与免疫细胞化学法相结合用于 CTC 的检测，是先将外周血中稀少的肿瘤细胞通过免疫磁珠特异性的富集，其肿瘤细胞的浓度可提高 103 ~ 104 倍，再进行免疫细胞化学检测和病理学检测，从而具有更高的灵敏度、准确率和可靠性。蔡清清等 [4] 应用结合表皮细胞黏附分子 ( EpCAM ) 抗体的免疫磁珠富集 52 例乳腺癌患者外周血中表达 EpCAM 抗原的肿瘤细胞，然后通过改良的免疫荧光细胞化学法检测 CK8 /18 阳性的肿瘤细胞。结果, 该方法敏感性较高，可从 1 ×107 个外周血单个核细胞中检测出 1 个癌细胞, 特异性达 100%。52 例乳腺癌患者的外周血中有 28 例检测到 CK 阳性细胞，阳性率为 53.8%。这项实验结果显示出免疫磁珠富集及免疫荧光细胞化学法检测 CTC 的灵敏度和特异性高。
2.2 免疫磁珠+ 逆转录聚合酶链反应 ( RT - PCT)
联合应用免疫磁珠和 RT- PCR 方法检测 CTC，是将免疫磁珠的特异性富集分离作用和 RT - PCR 的高灵敏度相结合，从而提高了外周血肿瘤细胞的检出率。Gou 等 [5] 应用免疫磁性分离技术，通过 CD45、Ber-EP4 抗体对 40 例大肠癌患者外周血中的肿瘤细胞进行富集，然后应用巢式 RT- PCR 方法对富集的肿瘤细胞进行 CK20mRNA 检测。结果显示该方法可从 1 m l 血中检测出 1 个癌细胞。包被 CD45、Ber-EP4、CD45 /Be r- EP4 抗体的免疫磁珠检测出 CK20 mRNA 的阳性率分别为 80.0%，82.5% 和 72.5%，在 Dukes A, B, C, D 阳性率分别为 0%，33.3%，86.7%，92.9%。该方法是一种无创、高灵敏度、高特异性的检测 CTCs 的方法。
2.3 免疫磁珠+ 流式细胞术
联合应用免疫磁珠和流式细胞术检测 CTC，是将免疫磁珠的特异性富集分离作用和流式细胞术的定量计数肿瘤细胞的优点相结合，从而具有更高的灵敏度、准确率和可靠性。Moreno 等 [6] 应用包被 EpCAM 抗体的免疫磁珠富集 37 例转移性前列腺癌患者 7.5 ml 外周血中肿瘤细胞，然后对标本进行多指标流式细胞术分析。结果每 7.5 ml 血中发现前列腺癌细胞的数量变化从 0~ 8 586 个，该方法是一种无创、简便、可靠、快速检测外周血微转移的方法。
2.4 免疫磁珠+ 荧光原位杂交
Wuifing 等 [7] 应用免疫磁珠富集分离 42 例乳腺癌患者外周血 CTC，然后用荧光原位杂交技术扩增 HER2。结果 35 例无明显转移患者中的 17 例检测到 1~ 8 个 CTC，而阳性对照组中，7 例有转移性疾病患者全部检测到 HER2 阳性。HER2 阳性 CTC 的存在和数量与无病生存期的明显缩短和总生存期明显相关。这项实验结果显示该方法是检测 CTC 的敏感方法，同时检测出的肿瘤细胞分子特性可以对预后提供有价值的信息。
2.5 新的免疫磁珠+流式细胞术
以色列 BioCep 公司开发了一种细胞分离富集新技术—CEPir 细胞分离系统。CEPir 细胞分离系统基于磁性细胞分选原理，是专门用于珍稀细胞分选，适用于免疫细胞，骨髓干细胞等的细胞分选的系统。该系统运用以色列的专利技术，可以实现珍稀细胞分选，从十亿个细胞中分离出 1 个靶细胞；流入式、零接触设计和恒流有氧环境对细胞活性具有突破性保护功能，使细胞存活率高达 99% 以上；提供四个分选区，分选磁场强度可调，流速可调，保证了细胞分离的 96-99% 纯度和 80-99% 回收率；分离高效快速，5-15 分钟内完成 109 个细胞分离，一次分离就可达标，无需重复操作；采用全封闭一次性硅胶管连接，避免了样品的交叉污染；分析通量最大为 50 ml，满足科学研究的需要；可用于无菌实验室环境；分选样品可以是全血或者血清。据以色列 BioCep 公司实验数据分析，CEPir 强大的细胞富集能力，仅用 15 mL 母体外周血，能够分离得到胎儿的有核红细胞。应用新技术 CEPir 富集外周血中含量稀少的循环肿瘤细胞，可以非常显著提高富集的效率，极大促进了循环肿瘤细胞检测的应用。
3. CTC 检测临床应用
CTC 在早期发现转移性结直肠癌，乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤的微转移、监测术后复发与转移、评估疗效与预后、选择合适的个体化治疗等方面的作用已得到大量研究的证实。
3.1 早期发现恶性肿瘤微转移
K im 等 [8] 应用免疫磁珠分选和免疫细胞化学方法研究能手术的和转移性乳腺癌患者外周血中的癌细胞，结果发现，21 例能手术的早期乳腺癌患者的血标本没有外周血微转移，而 29 例转移性乳腺癌患者中有 8 例发现外周血微转移，肿瘤细胞的数量为 2~ 90 个。外周血微转移与复发的第一部位、侵犯器官的数量、肿瘤的标记物状况、体力状态、疾病缓解时间无重要关系，而与孕激素受体有关。以上研究结果表明，外周血微转移在能手术的早期乳腺癌患者中是罕见的，但在转移性乳腺癌患者中很多。由此可知当我们在外周血中发现肿瘤细胞时即提示转移的存在。
Beitsch 等 [9] 为确定早期及晚期乳腺癌患者外周血中 CTC 的数量，采用了免疫磁珠分选和流式细胞计数、细胞形态学、免疫细胞化学方法进行研究，结果早期乳腺癌患者 20 ml 血中平均有 16 个上皮细胞，转移性乳腺癌患者平均有 122 个肿瘤细胞。由此可见该方法能确定 CTC 的数量，且明确转移性乳腺癌比早期乳腺癌有更多的 CTCs，该方法能够筛选高危患者，决定是否需要辅助治疗及随访，早期发现乳腺癌的复发。
Aay 等 [10] 应用包被 Ber-EP4 抗体的免疫磁珠对 42 例前列腺癌患者外周血中的肿瘤细胞进行富集，然后应用实时定量 PCR 方法对富集的 CTC 进行 HER2 mRNA 检测。在 42 例标本中，11 例有转移患者标本中的 6 例检测到了 CTC，31 例无转移的标本中仅有 3 例检测阳性，其结论是，该方法是一种省时、简便、微创、高灵敏度、高特异性的检测方法，而且更容易发现进展期的前列腺癌患者。
3.2 检测术后复发与转移
王晓光等 [11] 应用免疫磁性分离及免疫细胞化学法检测 15 例 I 期非小细胞肺癌患者术前术后外周血中的 CTC。结果有 5 例患者外周血 CTC 检测阳性，有 2 例术前及术后检测均为阳性的患者发生了复发。其结论是，该方法是检测早期肺癌 CTC 的敏感方法；早期非小细胞肺癌患者 CTC 的检出可能与临床预后有一定的关系。
3.3 评估疗效与预后
Nakamura 等 [12] 应用包被 Ber-EP4 的免疫磁珠富集 47 例原发性食管鳞癌患者外周血中单核细胞，然后用抗 CK 抗体免疫染色。结果 47 例标本中的 18 例检测到 CK 阳性细胞。检出率与疾病分期密切相关。经过食管癌切除术的 33 例患者, 7 例无转移患者中的 4 例检测出 CK 阳性, 26 例出现远处淋巴结或肺转移患者中仅 2 例 CK 阴性表达。7 例在化疗或化放疗前 CK 阳性表达的患者 4 例经治疗后阴性表达继续生存而 3 例仍保持阳性患者 6 个月内死亡。
Cohen 等 [13-14] 利用免疫磁珠分离技术和流式细胞仪，发现在转移性结直肠癌患者中，治疗前和治疗过程中 CTC 的数量能够作为无进展生存期和总生存期的独立预测因子，与影像学检查协同判断患者的预后；在以不同的治疗方法或是患者特征划分的特定亚组中，基线 CTC 的计数同样可以作为判断预后的重要因素。
3.4 选择合适的个体化治疗策略
Chen 等 [ 15] 应用免疫磁珠富集分离单核细胞，然后对细胞涂片进行免疫细胞化学法检测癌胚抗原、人端粒酶逆转录酶、CD34 和 CD45 的表达，并对其中的胃癌细胞进行生物学特性分析。结果在 24 例胃癌患者的外周血中有 10 例找到了癌细胞, 阳性率为 41.7%；癌细胞的检出与肿瘤原发灶的病理分级相关。其结论是，联合应用免疫磁珠富集分离和免疫细胞化学法可检测到胃癌患者外周血中的癌细胞，并可据此拟定治疗方案并对患者的预后作出判断。
在一个多中心、前瞻性的研究中，对 177 例复发转移性乳腺癌检测 CTC，发现在治疗前≥5 个肿瘤细胞/7.5 ml 血的患者有较短的 PFS( 2.7 个月 vs. 7.0 个月) 和较短的 OS ( 10. 1 个月 vs. 18 个月) [16] 。另一项研究也发现治疗前每 7.5 m l 血≥ 5 个肿瘤细胞，但治疗后< 5 个/7.5m l 血的患者与< 5 个/7. 5m l 血的患者有着相似的 PFS 和 OS，表明 CTC 作为一个预后因子的重要价值以及通过 CTC 可以筛选出能够从化疗中获益的人群 [ 17]。
4. 展望
综上所述，外周血中 CTC 的检测具有非常重要的意义，免疫磁性分选技术在医学领域的应用越来越广泛，尤其是在检测 CTC 的应用更是令人瞩目，已成为研究的热点。将其与免疫细胞化学法、RT- PCR、流式细胞术、荧光原位杂交等技术以及 CK、CEA、Ber- EP4、端粒酶等肿瘤特异性标记物相结合，使免疫磁性分选技术的优越性更加充分的发挥出来。以色列 BioCep 公司开发专门用于珍稀细胞分选的 CEPir 细胞分选系统作为新的 CTC 富集方法，可以大大提高 CTC 富集效率和临床应用范围。
参考文献
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