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Ⅰ相代谢稳定性研究原理及实验方法
人阅读 发布时间：2021-12-23 13:34
Ⅰ相代谢稳定性研究原理及实验方法
1 概述
1.1 药物代谢研究简介
药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。
药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。
由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。
1.2 药物代谢
药物代谢，又称药物的生物转化（biotransformation），是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程，是药物从体内消除的主要方式之一。药物在体内的生物转化，分为Ⅰ相代谢反应和Ⅱ相代谢反应。
肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢的各种酶。在肝脏中，参与药物代谢的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶中以P450酶重要，它是一种以铁卟啉为辅基的蛋白质。P450酶存在明显的种属、性别和年龄的差异，其中以种属差异表现明显，不同种属的P450同工酶的组成不同，因此药物在不同种属的动物和人体内的代谢产物可能是不同的。
1.3 药物的Ⅰ相代谢
药物在Ⅰ相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过Ⅰ相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。
氧化反应是最多见的第Ⅰ相反应，单加氧酶系是氧化异源物最重要的酶，单加氧酶主要存在于滑面内质网的微粒体中，能催化烷烃、烯烃、芳烃和类固醇等多种物质进行氧化。由细胞色素P450、NADPH+H+、NADPH-细胞色素P450还原酶（以FAD为辅基的黄酶），催化基本反应为：
RH+O2+NADPH+H+→ROH+NADP++H2O
单加氧酶能直接激活氧分子，使其中一个氧原子直接加入底物分子中形成羟化物或环氧化物，另一个氧原子则被NADPH还原为水。由于一个氧分子发挥了两种功能，故单加氧酶系又称为混合功能氧化酶；又因底物的氧化产物是羟化物，所以又称为羟化酶。加单氧酶的反应见图1：
图1 加单氧酶的反应
肝细胞微粒体内存在的还原酶主要有硝基还原酶和偶氮还原酶，是第Ⅰ相反应的主要还原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物还原生成胺类（见图2）。
图2 硝苯和偶氮苯的还原反应
肝微粒体中含有多种水解酶，如酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分别催化酯类、酰胺类、糖苷类化合物的水解（见图3），以降低或消除其生物活性。
图3 乙酰水杨酸的水解反应
2 Ⅰ相代谢稳定性实验原理
肝药酶CYP即细胞色素P450氧化酶（CYP450），属于单加氧酶（momooxygenase），也称肝微粒体混合功能氧化酶，多位于内质网和线粒体内壁上，参与药物、致癌物、类固醇激素和脂肪酸等多种内、外源性物质代谢。肝药酶CYP氧化还原酶（POR）是所有肝微粒体酶的电子供体，通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）将电子传递给CYP450酶，CYP450酶得到电子后再与底物发生氧化还原反应，从而发挥代谢活性。
肝微粒体中包含了大部分Ⅰ相酶，其中最重要的是以CYP450为主要成分的微粒体混合功能氧化酶系统，在用肝微粒体进行研究时，如加入相应的辅助因子NADPH，则可重组体外代谢体系，从而通过体外温孵法进行Ⅰ相代谢稳定性研究。
3 肝微粒体体外温孵法实验方法描述
肝微粒体体外温孵法是采用肝微粒体，辅以NADPH再生系统，在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物和其代谢产物，并对代谢产物进行初步的分析和鉴定的方法。
3.1 肝微粒体制备
微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图4）：
图4 肝微粒体制备流程图
3.2 体外孵育体系的建立
Ⅰ相代谢稳定性研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。
推荐使用的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，NADPH发生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁）；0.5 mg/mL的肝微粒体蛋白；合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，以不包含NADPH发生系统的样品作为阴性对照。于预设的反应时间点，如0，5，10，15，30，60 min后加入等体积预冷的乙终止反应。
3.3 原型药物或代谢产物的检测
采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物和其代谢产物。图5为采用LC-MS/MS测定药物在人、犬和大鼠肝微粒体中的代谢情况，从图上可知，药物在三种肝微粒体中均存在明显代谢，但不同种属间又存在显著差异。
图5药物在人，犬，大鼠肝微粒体中的代谢情况
4 汇智泰康Ⅰ相代谢稳定性试剂盒简介
北京汇智泰康医药技术有限公司针对药物代谢研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，开发了一款专门用于Ⅰ相代谢稳定性研究的试剂盒，该产品可直接用于药物的Ⅰ相代谢稳定性研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合Ⅰ相代谢稳定性研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。
4.1 产品说明
本产品提供了药物Ⅰ相代谢研究用到的肝微粒体、NADPH再生系统及其它组分，可直接用于药物Ⅰ相代谢稳定性的研究。本产品可提供肝微粒体有：人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体，可根据实际需求，选择不同种属的肝微粒体。
4.2 试剂盒优势
便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。
准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。
4.3 产品组成
50反应/盒，200μL/反应。
4.4 产品使用说明
本产品需于-70℃冰箱冷冻保存，切记避免反复冻融。试验具体操作如下：
4.4.1 试验组
1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；
2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min；
例：200μL孵育体系配制：
注：a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%。
b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。
3）将以上混合液195μL/管分装至1.5mL离心管中，于37℃水浴中保温， 5μL/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；
4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入200μL预冷的乙终止反应（预冷乙：孵育体系体积=1:1）。
4.4.2 对照组
1）阳性对照组：将受试物换为阳性底物；
2）阴性对照组：不加A液、B液；
3）空白对照组：只包含底物和PBS缓冲液。
4.5 运输条件
干冰运输。
4.6 使用注意事项
1）验开始前，请自行准备1.5mL离心管、不同规格枪头、乙、37℃水浴锅等。
2）产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断。
3）用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀。
4）-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融。
5)用过程中，也可根据实际实验需求调整各组分的加入量。
1 概述
1.1 药物代谢研究简介
药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。
药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。
由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。
1.2 药物代谢
药物代谢，又称药物的生物转化（biotransformation），是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程，是药物从体内消除的主要方式之一。药物在体内的生物转化，分为Ⅰ相代谢反应和Ⅱ相代谢反应。
肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢的各种酶。在肝脏中，参与药物代谢的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶中以P450酶重要，它是一种以铁卟啉为辅基的蛋白质。P450酶存在明显的种属、性别和年龄的差异，其中以种属差异表现明显，不同种属的P450同工酶的组成不同，因此药物在不同种属的动物和人体内的代谢产物可能是不同的。
1.3 药物的Ⅰ相代谢
药物在Ⅰ相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过Ⅰ相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。
氧化反应是最多见的第Ⅰ相反应，单加氧酶系是氧化异源物最重要的酶，单加氧酶主要存在于滑面内质网的微粒体中，能催化烷烃、烯烃、芳烃和类固醇等多种物质进行氧化。由细胞色素P450、NADPH+H+、NADPH-细胞色素P450还原酶（以FAD为辅基的黄酶），催化基本反应为：
RH+O2+NADPH+H+→ROH+NADP++H2O
单加氧酶能直接激活氧分子，使其中一个氧原子直接加入底物分子中形成羟化物或环氧化物，另一个氧原子则被NADPH还原为水。由于一个氧分子发挥了两种功能，故单加氧酶系又称为混合功能氧化酶；又因底物的氧化产物是羟化物，所以又称为羟化酶。加单氧酶的反应见图1：
图1 加单氧酶的反应
肝细胞微粒体内存在的还原酶主要有硝基还原酶和偶氮还原酶，是第Ⅰ相反应的主要还原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物还原生成胺类（见图2）。
图2 硝苯和偶氮苯的还原反应
肝微粒体中含有多种水解酶，如酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分别催化酯类、酰胺类、糖苷类化合物的水解（见图3），以降低或消除其生物活性。
图3 乙酰水杨酸的水解反应
2 Ⅰ相代谢稳定性实验原理
肝药酶CYP即细胞色素P450氧化酶（CYP450），属于单加氧酶（momooxygenase），也称肝微粒体混合功能氧化酶，多位于内质网和线粒体内壁上，参与药物、致癌物、类固醇激素和脂肪酸等多种内、外源性物质代谢。肝药酶CYP氧化还原酶（POR）是所有肝微粒体酶的电子供体，通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）将电子传递给CYP450酶，CYP450酶得到电子后再与底物发生氧化还原反应，从而发挥代谢活性。
肝微粒体中包含了大部分Ⅰ相酶，其中最重要的是以CYP450为主要成分的微粒体混合功能氧化酶系统，在用肝微粒体进行研究时，如加入相应的辅助因子NADPH，则可重组体外代谢体系，从而通过体外温孵法进行Ⅰ相代谢稳定性研究。
3 肝微粒体体外温孵法实验方法描述
肝微粒体体外温孵法是采用肝微粒体，辅以NADPH再生系统，在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物和其代谢产物，并对代谢产物进行初步的分析和鉴定的方法。
3.1 肝微粒体制备
微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图4）：
图4 肝微粒体制备流程图
3.2 体外孵育体系的建立
Ⅰ相代谢稳定性研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。
推荐使用的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，NADPH发生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁）；0.5 mg/mL的肝微粒体蛋白；合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，以不包含NADPH发生系统的样品作为阴性对照。于预设的反应时间点，如0，5，10，15，30，60 min后加入等体积预冷的乙终止反应。
3.3 原型药物或代谢产物的检测
采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物和其代谢产物。图5为采用LC-MS/MS测定药物在人、犬和大鼠肝微粒体中的代谢情况，从图上可知，药物在三种肝微粒体中均存在明显代谢，但不同种属间又存在显著差异。
图5药物在人，犬，大鼠肝微粒体中的代谢情况
4 汇智泰康Ⅰ相代谢稳定性试剂盒简介
北京汇智泰康医药技术有限公司针对药物代谢研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，开发了一款专门用于Ⅰ相代谢稳定性研究的试剂盒，该产品可直接用于药物的Ⅰ相代谢稳定性研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合Ⅰ相代谢稳定性研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。
4.1 产品说明
本产品提供了药物Ⅰ相代谢研究用到的肝微粒体、NADPH再生系统及其它组分，可直接用于药物Ⅰ相代谢稳定性的研究。本产品可提供肝微粒体有：人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体，可根据实际需求，选择不同种属的肝微粒体。
4.2 试剂盒优势
便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。
准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。
4.3 产品组成
50反应/盒，200μL/反应。
| 产品名称 | 规格 | 数量 |
| A液（20×） | 600μL /支 | 1支 |
| B液（100×） | 120μL /支 | 1支 |
| 肝微粒体（20mg/mL） | 300μL /支 | 1支 |
| 阳性底物（200×） | 50μL /支 | 1支 |
| 0.1M PBS缓冲液 | 12mL/瓶 | 1瓶 |
本产品需于-70℃冰箱冷冻保存，切记避免反复冻融。试验具体操作如下：
4.4.1 试验组
1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；
2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min；
例：200μL孵育体系配制：
| 名称 | 加入量（μL） |
| A液(20×) | 10 |
| B液(100×) | 2 |
| 肝微粒体（20mg/mL） | 5 |
| 受试物（200×） | 1 |
| 0.1M PBS缓冲液 | 182 |
b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。
3）将以上混合液195μL/管分装至1.5mL离心管中，于37℃水浴中保温， 5μL/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；
4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入200μL预冷的乙终止反应（预冷乙：孵育体系体积=1:1）。
4.4.2 对照组
1）阳性对照组：将受试物换为阳性底物；
2）阴性对照组：不加A液、B液；
3）空白对照组：只包含底物和PBS缓冲液。
4.5 运输条件
干冰运输。
4.6 使用注意事项
1）验开始前，请自行准备1.5mL离心管、不同规格枪头、乙、37℃水浴锅等。
2）产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断。
3）用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀。
4）-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融。
5)用过程中，也可根据实际实验需求调整各组分的加入量。
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