肝纤维化常由两类慢性肝损伤引起：肝毒性损伤和胆汁淤积性损伤。其中肝毒性损伤是由外部因素引起的细胞损伤引起的，包括：乙型和丙型肝炎（HBV 和 HCV）病毒感染、酒精性（ASH）和非酒精性（NASH）脂肪性肝炎。

 

2020 年，Nature Reviews Drug Discovery 杂志上发表了题为《RNAi therapeutics on the rise》的文章，分析了全球 431 个核酸药物在研项目，其适应症覆盖肿瘤、代谢疾病和传染病等多个疾病领域，未来 5～10 年将会迎来属于核酸药物的「黄金时代」。

 

通过 siRNA 和 ASO（反义寡核苷酸）疗法（它通过与乙肝病毒的 RNA 结合，抑制病毒蛋白的表达，从而达到降低 HBsAg 表达的作用，见表 1）与刺激人体免疫系统的干扰素 α（激活免疫系统）联用疗法，可以实现 30.8% 的乙型肝炎的功能性治愈，即 30.8% 的慢性乙肝患者体内检测不到乙肝表面抗原（HBsAg），这些患者同时体内出现抗乙肝蛋白的抗体（抗乙肝抗体 >10 mIU/mL），显示出免疫系统对乙肝蛋白产生免疫反应的迹象。

表 1   siRNA 和 ASO 疗法的区别（Clin Mol Hepatol. 2022 Jul;28(3):408-424.）
 

图 1   siRNA 和 ASO 治疗 HBV 的机制（Clin Mol Hepatol. 2022 Jul;28(3):408-424.）

 

「肝纤维化」

 

肝纤维化是一个临床重要的指标，对患者的发病率和死亡率有重大影响。纤维化的机制涉及许多不同的细胞途径，但主要是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）。

 

许多肝病，包括乙型、丙型肝炎和 NASH 疾病，都会导致持续的肝细胞损伤，从而导致肝纤维化（见图 2）。年龄和性别与肝纤维化的发生进展率密切相关，比如年龄在 60-70 岁之间的男性肝纤维化进展的概率估计比一个 20−40 岁的男性高 300 倍，女性的肝纤维化进展率比男性低 10 倍。原因是年龄可以改变身体的氧化应激、血流量（调节门静脉血压）和线粒体功能和免疫反应。无论肝脏疾病的原因如何，肝脏相关的死亡率都随着纤维化的增加而呈指数级增长。因而研发治疗或者缓解肝纤维化的药物是一个重要的未满足的临床需求。

图 2   引起肝纤维化的常见原因及发病机理（WIREs Mech Dis. 2021 Jan;13(1):e1499）

 

稳定的 HBV 诱导的慢性肝炎肝纤维化动物模型
 

在我国有 9000 万慢性乙肝患者，其中有 2800 万需要治疗，特别是肝纤维化和肝硬化患者，亟需疗效确切的药物。因而建立稳定的 HBV 诱导的慢性肝炎肝纤维化动物模型对于乙肝肝纤维化病理机制及其药物评价具有重要意义。使用维通达研发的 HBV-Tg 小鼠，黄恺等在中国实验动物学报发表了《两种乙肝肝纤维化小鼠复合模型的比较》的研究，两种复合模型均符合乙肝肝纤维化模型需求，其差异主要集中于病毒学指标以及病理改变。 rAAV+CCL4 组在 HBV-DNA 载量上具有优势（比较灵活，可以通过尾静脉注射 AAV 病毒的载量进行调整），Tg+CCL4 组在纤维化进展更为明显（见图 3）。

图 3 肝组织病理 HE、天狼星红染色与胶原半定量分析

 

乙肝肝纤维化动物模型的构建
 

构建慢性乙肝肝纤维化动物模型需具备两个基本要素：首先是 HBV 基因的高水平表达, 其次具有长期性的 HBV 感染及相应的纤维化的病理特征。黄恺等研究发现：HBV Tg 组与 rAAV 组在联合 CCL4 染毒后能够稳定成模。两者血清生化学差异并不明显，其差异主要体现在病毒学标志物方面。HBV-DNA 结果可以看到：由于 rAAV8 本身具有剧烈嗜肝性，注射机体后破坏肝细胞使大量 HBV-DNA 释放入血，并且肝组织中 HBcAg 大面积表达是其典型特征。rAAV8 注射后，机体自身免疫应答升高, 血清中出现 Anti-HBs，血清学转换发生，部分 HBsAg 被清 除，导致血清与肝组织中 HBsAg 和 HBeAg 水平较 HBV-Tg 组偏低。纤维化进展方面；Tg +CCl 4 组则更为明显，其原因和自然杀伤 T 细胞加速并释放细胞因子 IL-4 和 IL-13 导致肝星状细胞活化有关。

 

维通达临床前小鼠乙肝药效学平台，验证了我国第一个用于慢性乙型肝炎治疗的在研 siRNA 疗法药物 RBD1016。在模型动物中观察到血清学转换，提示该药对慢乙肝具有功能性治愈潜力。不清楚造成 HBV 严格种属特异性的原因，限制了 HBV 动物模型的研发和临床前选择的困境。尽管如此，目前已有的模型可以部分模拟 HBV 感染患者的特征，合理的选择这些模型，将有助于加快药筛进程、验证新疗法和更快解决 HBV 生物学发病机制等方面的问题。