聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似 DNA 分子的天然复制过程，是将在待扩增的 DNA 片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于 DNA 克隆及基因分析的必需工具。

一、PCR 实用技巧—增加 PCR 特异性

1. primers design

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这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的 primer 要符合下面一些条件：

1) 足够长，18～24 bp，以保证特异性，当然，不是说越长越好，太长的 primer 同样会降低特异性，并且降低产量；

2) GC%，40%~60%；

3) 5'端和中间序列要多 G/C，以增加稳定性；

4) 避免 3' 端 GCrich，最后 5 个碱基不要多于 2 个 G/C；

5) 避免 3' 端的互补，否则，容易造成 DIMER；

6) 避免 3' 端的错配；

7) 避免内部形成二级结构；

8) 附加序列（RTsite，Promoter sequence）加到 5' 端，在算 Tm 值时不算，但在检测互补和二级结构时要加上它们；

9) 使用兼并 primer 时，要参考密码子使用表，注意生物偏好性，不要在 3' 端使用兼并 primer，并使用较高的 primer 浓度（1 μM～3 μM）；

10) 最好学会使用一种 design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Onlinedesign et al.

二、PCR 扩增重要标准—灵敏度

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灵敏度指的是 PCR 扩增反应能够检测到目的基因最小值。研究结果表明，影响 PCR 扩增效率的因素，如，模板的复杂程度与完整性、引物纯度及其与模板结合效率、反应温度、DNA 的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成（主要指：阳离子）、反应优化剂等，均决定 PCR 实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下，常规 PCR 反应能够检测到 pg（10-12 g）数量级目的基因。对于一个特定的目的基因，模板与引物通常都是已经限定好的因素。因此，选择什么样的 PCR 反应体系（包括：DNA 聚合酶与反应缓冲液等）就是研究者提高 PCR 实验灵敏度的关键因素了。

与实验室自配 PCR 扩增体系相比，东盛 PCR Mix 对反应缓冲液中的成分进行了优化，并加入了适当比例的反应增强剂（PCREnhancer），提高了 DNA 聚合酶热稳定性，显著降低模板二级结构对 PCR 扩增性能的影响，使得 DNA 聚合酶处于最适活性状态，从而获得比自配体系更高的检测灵敏度。即使反应体系中只有几个目的基因拷贝，也能轻松检测。

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三、PCR 扩增重要标准—特异性

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特异性指的是在 PCR 扩增过程中，专一性扩增目的片段而非其他片段的性能。在 PCR 实验本身的灵敏度很高，且实验条件未充分优化的情况下，通常会在目的片段出现同时伴随有其他杂带，即，发生非特异性扩增现象。模板、引物性质及质量、反应条件控制等均会影响 PCR 扩增特异性。近年，研究结果表明，缓冲液品质（如，离子种类与组成，反应优化剂等）对保证 PCR 特异性扩增起着不可忽视的作用。一般缓冲液中调节氢键作用的盐只有 KCl，而我们东盛 OptimusTM Hotstart Taq Mix 的缓冲体系通过反应优化剂以及 KCl/NH4Cl 盐离子体系调节平衡，显著提高 PCR 扩增特异性，降低背景。同时，OptimusTM Hotstart Taq Mix 采用了化学修饰的热启动酶，能有效抑制非特异性扩增，适用于多重 PCR 反应，可以于常温配制反应体系。

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PCR 实验灵敏度与特异性是一对此长彼消的特性，这也决定我们实验体系的调节实际上就是需要找到适合实验灵敏度与特异性的平衡点。由于 PCR 体系中的成分众多，使得组合较多，筛选工作繁杂。我们东盛基于灵敏度与特异性分别设计了 PCR Mix 和 OptimusTM Hotstart Taq Mix，帮您确定大致平衡点，如果您需要更细致的平衡点，请选择相应的 Kit 系列进行微调。

 
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