使用Ghost cytometry进行高通量细胞表型的池式CRISPR筛选

CRISPR基因编辑池式筛选是一种使用CRISPR基因编辑技术进行高通量基因筛选的方法。该方法灵活且高效，能够在单次实验中同时对成千上万的基因进行编辑，为研究者在生物医学研究领域提供了强大的工具。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是细菌或古菌的一种免疫机制，能够帮助它们抵抗病毒等外源遗传物质的入侵。在2012年，科学家发现了其在基因编辑上的潜力，他们利用CRISPR关联蛋白（Cas）能够被引导至任何DNA序列并精确剪切，实现了目标基因的定向编辑。

池式筛选，即在一个大的“池子”里，每个细胞携带一个不同的基因编辑工具-指导RNA（gRNA）。这种编辑工具可以引导Cas蛋白至特定的基因进行编辑。在CRISPR池式筛选中，研究者可以使用含有数以千计不同gRNA的质粒库对大量细胞进行转染，使每个细胞内接收到一个随机的gRNA。

传统的基因筛选方法通常会对单个基因或一小组基因进行逐个测试，这种做法比较耗时且效率较低。某些筛选方法，例如通过微生物菌落挑选或表达差异分析等，虽然可以同时处理多个样品，但是每个基因通常都需要单独处理和分析。

而“池式筛选”方法则是一种高通量筛选技术。在一个“池子”中，每个细胞被赋予一个特定的基因编辑工具，比如CRISPR的gRNA，就形成了一个大规模基因编辑池。然后，通过对整个细胞池进行外部压力处理，可以一次性筛选出许多对生存或生长有影响的基因。这样就可以在单个实验中对全基因组进行筛选，大大提高了筛选效率。

文章的介绍部分详述了基于CRISPR的池式筛选方法的几个优势，包括提高通量，降低成本，减少了不同筛选中出现的批次效应。在池式的表型筛选中，细胞和细胞内分子被标记为荧光染料、报告基因或荧光免疫抗体。因为需要量化明确定义的特征，所以基于荧光的标记由于其对目标分子的高特异性和高灵敏度具有明显的优势。例如，在荧光激活细胞分类（FACS）中，从时间信号中测量的代表性值，如总荧光，或从光学显微图像中评估的更详细的特性，如分子定位和形态参数。

然而，当适用的生物标志物或染色方法不可用，能否在用识别特征的图像分析评估细胞表型变得具有挑战性。为了解决这个挑战，基于机器学习的无标记高内容细胞表型分析成为一个有希望的替代方案。

在这项研究中，作者展示了一种用于大规模池化CRISPR筛选的多功能方法，包括荧光和无标记高内容细胞表型，利用基于荧光和无标签Ghost Cytometry（GC）技术的细胞分类器。

首先，细胞表达Cas9蛋白被用池化CRISPR逆转录病毒库转导以实现功能丧失基因集，并选出稳定病毒整合。随后，经化合物或试剂处理的池化敲除细胞库显示出多种表型。如有必要，可以进行额外的试验，例如免疫染色。在GC-based的细胞分选中，预训练的机器学习模型可以选择性地丰富显示目标高内容表型的细胞。最后，可以将筛选的细胞进行各种生物学试验，包括基因分析如基因组测序，蛋白质试验以及基于细胞的功能性分析。在标准CRISPR扰动筛选中，从筛选细胞中提取基因组DNA，并由PCR扩增sgRNA区域，然后利用商业上可得的下一代测序平台阅读，以确定导致目标表型的基因。当筛选活细胞时，单细胞RNA测序的转录组学分析和基于细胞的功能试验是广泛适用的。

所以，整体来看，这种方法结合了CRISPR基因编辑技术，无标签高内容筛选和机器学习，进一步提高了我们对基因功能和表型的理解，以及我们在生物医学研究中的筛选能力。