文章标题：Ciliary transition zone proteins coordinate ciliary protein composition and ectosome shedding

发表期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

作者单位：上海交通大学医学院

百趣生物提供服务：Label free非标记定量蛋白质组学

研究背景

纤毛是从细胞表面突出的保守的天线状结构，含有许多信号相关分子，可维持细胞稳态并调节组织发育，为了控制特定的纤毛组成，纤毛基部的一个名为过渡区（Transition Zone，TZ）的专用区域充当“守门人”，是控制纤毛蛋白进出的扩散屏障。TZ蛋白的异常会破坏其屏障和筛选功能，并导致影响多个主要器官的综合征，这些综合征属于纤毛相关人类疾病。

而迄今为止，不同TZ蛋白如何独特而系统地控制纤毛蛋白的分选以进行纤毛组装和信号传导在很大程度上仍然是未解之谜。衣藻是研究纤毛的优秀模式生物，上海交通大学医学院曹木青老师团队采用莱茵衣藻对此进行了深入研究，让我们一起走进作者的研究故事。

技术路线

研究成果1、TCTN1的缺失会减少衣藻的纤毛发生

为了识别与纤毛组装相关的新基因，作者对衣藻进行正向遗传筛选得到纤毛病相关基因突变体，然后对基因进行鉴定将其突变体命名为TCTN1。TCTN1细胞没有明显的纤毛，用HA标记(HA-tagged)的全长TCTN1 DNA片段转化TCTN1突变体后恢复了TCTN1表达，并挽救了纤毛组装缺陷，证明纤毛表型是由TCTN1突变引起的，而衣藻TCTN1是一种TZ蛋白，在纤毛发生中起作用。

图1. 衣藻TCTN1突变体的表征

2、TCTN1的缺失导致纤毛的结构异常

通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）研究衣藻纤毛的超微结构，发现WT(wild-type cells)中TZ的纵截面中形成非常突出的楔形结构，而TCTN1突变体中没有观察到该楔形结构，在rescued后楔形结构又会出现。有趣的是，纤毛膜表面的糖萼在TCTN1突变细胞中被严重破坏。

图2. TCTN1的缺失导致纤毛和TZ的结构异常

3、TCTN1在TZ超微定位独立于CEP290和NPHP4蛋白之间

作者使用超高分辨率显微镜证实了TCTN1定位在CEP290和NPHP4基因之间，然后通过免疫金透射电镜发现TCTN1定位在细胞膜上。此外，作者在tctn1、cep290、nphp4和WT细胞(4种类型细胞)中进行了免疫染色测定，发现TCTN1的定位与其他两种蛋白质（CEP290和NPHP4）无关。

图3. TCTN1独立位于CEP290和NPHP4之间

4、TCTN1缺失导致纤毛蛋白组分异常

据报道，TCTN蛋白有助于动物细胞纤毛膜蛋白在纤毛内的富集。然而，TZ突变体纤毛蛋白组成的系统性变化尚不清楚。作者采用Label free非标记定量蛋白质组学（由百趣生物提供）对从WT、 tctn1、cep290和nphp4细胞纯化的纤毛进行了蛋白质组学分析，对蛋白质组学数据展开分析发现，TCTN1中纤毛的蛋白质种类增加较多，表明TZ中的缺陷不仅损害了纤毛膜蛋白质浓度，还导致其屏障功能的丧失，从而造成非纤毛蛋白涌入纤毛。然后通过WB+IF验证了蛋白质组学数据。令人惊讶的是，可能通常不存在于纤毛但存在于高尔基体、叶绿体和线粒体中的细胞器蛋白被转运到TCTN1突变体的纤毛中。上述结果表明，有缺陷的TZ允许细胞质蛋白进入纤毛，这与TZ在排除非纤毛蛋白方面的假定功能以及纤毛蛋白在纤毛中的门控作用一致。

图4. TCTN1的缺失削弱了TZ的纤毛门控作用

5、不同TZ蛋白特异调节纤毛组成

TZ突变体的表型差异表明，不同TZ蛋白在控制纤毛组成中起着特定的作用。为了系统地评估TZ蛋白在纤毛组成调控中的功能，对蛋白组学数据展开进一步分析发现，共鉴定到2845种蛋白质。从研究结果中可以看出每个TZ蛋白的丢失都会导致纤毛组成的特异性变化，而CEP290的突变似乎导致TZ中更严重的缺陷。

图5. 不同TZ蛋白对纤毛中的蛋白质进行差异调节

6、TZ蛋白调节纤毛外泌体的形成纤毛可产生具有生物活性的外泌体，在纤毛信号传导的调节中具有多种功能。从纤毛蛋白质组学数据中，作者注意到突变细胞纤毛中外泌体相关蛋白量减少。考虑到TZ在纤毛膜组成控制中的重要作用，纤毛外泌体形成可能受到TZ缺陷的影响。此外，TZ突变体从母细胞壁孵化的缺陷也表明TZ突变纤毛中外泌体的形成发生了变化。

图6. 在配子交配期间，纤毛外泌体的形成受TZ完整性的调节

7、TCTN1在纤毛TZ调节外泌体的组成和活性

在作者之前的研究中，纤毛外泌体表现出生物活性，而假交配可以用来评估纤毛外泌体生物活性。通过进一步研究，发现来自TZ突变体的外泌体，特别是来自tctn1或cep290组的外泌体生物活性显著降低，证明TZ在调节纤毛外泌体的生物活性和蛋白质组成中也起重要作用。

图7. 不同TZ突变体的纤毛外泌体活性和蛋白质组成结论作为从细胞体到纤毛的唯.一运输途径，TZ在纤毛组成的调节中起着至关重要的作用，这从根本上定义了纤毛的生物过程和功能。研究表明，TCTN1对于TZ的超微结构的正确组装是必不可少的。通过对WT、tctn1、cep290和nphp4细胞纤毛的蛋白质组学分析，作者系统地描述了突变体的纤毛蛋白结构，揭示了每个TZ蛋白的独特功能。发现TZ中的缺陷损害了纤毛外小体的形成和生物活性。该研究结果为TZ蛋白对纤毛组成的调控提供了系统的见解，并揭示了TZ和纤毛外泌体之间的联系。依据本文研究，作者提出了两个全新的观点：

• 一般认为，TZ相关纤毛病的发病原因为纤毛膜蛋白的丢失，此研究提示TZ缺陷引起的非纤毛蛋白涌入也可能是疾病发生的原因。

• 因为TZ可以调控外泌体的释放，所以纤毛TZ的缺陷可能通过外泌体途径来影响疾病的发生。为后续进一步研究提供了新的研究思路和方向。