阿趣代谢组学全国巡讲如火如荼的进行着，某日有老师问 Lavender，为什么都是多组学发的高分文章，我只想做代谢组学可以发高分吗？
 
答案当然是 Yes。接下来 Lavender 就为大家分享由大连物化所许国旺老师课题组今年 2 月份发表在 HEPATOLOGY 上面的一篇文章。文章的题目为：A Large-Scale, Multicenter Serum Metabolite Biomarker Identification Study for the Early Detection of Hepatocellular Carcinoma。
 

 
摘要
 
HCC（肝细胞癌）是全球较致命的恶性肿瘤之一，全球约有 50％ 的新病例和死亡相关的肝癌发生在中国。目前 HCC 在高危人群中的早期诊断仍然具有挑战性，所以发现新型标志物是一个迫切的需求。该实验通过纳入 1448 名受试者，采用 LC-MS 分析技术，鉴定并验证到了一组新型的肝癌组合代谢标志物：甘氨酸胆酸、苯丙酰色氨酸。
 
实验设计


 
图 1 实验设计 NC：正常对照；Cir：肝硬化；CHB：慢性乙型肝炎；HCC：肝细胞癌；S-HCC：小肝细胞癌； GSC：胃癌；ICC：肝内胆管细胞癌
 
① 训练集包含 108 个样本，用来发现候选 biomarker。
 
② 测试集包含 684 个样本，用来测试候选 biomarker，找到潜在 biomarker；其中 S-HCC 样本用来评估早期肝癌的代谢标志物。
 
③ 验证集中 572 个样本组成的队列 1 用来建立代谢物组合回归模型，并分别评价他们的诊断性能。队列 2 是一个巢式病例对照研究，将建立好的组合回归模型应用到 cohort2 队列中，再次评估这个生物标志物组合对于 HCC 的预测能力。
 
研究方法
 
血清样本收集
 
禁食过夜后，6:00-8:00 am 收集临床血清样本
 
检测平台
 
训练集，测试集：ACQUITY UPLCTM + Q-Trap 5500
 
验证集：LC (Nexera x2)-MS (TQ8050)
 
数据库：home-developed database(>2000) , HMDB, metlin
 
By the way，这里的训练集和测试集检测用到了拟靶向的方法。
 

 
图 2 拟靶向检测原理（Shili Chen, Guowang Xu,et al. Pseudotargeted Metabolomics Method and Its Application in Serum Biomarker Discovery for Hepatocellular Carcinoma Based on Ultra High-Performance Liquid Chromatography/Triple Quadrupole Mass Spectrometry,analytical chemistry）
 
之前 Biotree 代谢组学微信公众号也曾推出拟靶向检测的案例分享，大家感兴趣的话可关注文末微信公众号深度阅读（文献分享 | 从 SWATH 到 MRM：一种新型高覆盖度靶向代谢组学技术）
 
数据分析
 
SIMCA-P：PCA，PLS-DA
 
Multi Experiment Viewer: Wilcoxon Mann-Whitney test，Benjamini-Hochberg-based false discovery rate
 
SPSS：Binary logistic regression，correlation analysis
 
Metaboanalyst：pathway analysis
 
研究结果
 
训练集筛选差异代谢物
 

 
图 3 (A) 训练集的 total PCA    (B) 多元变量统计结果    (C) 单变量统计分析结果
 
结合多变量统计分析和单变量统计分析，后来筛选到 17 个候选 biomarker。
 
筛选验证潜在 biomarker
 
首先考察这 17 个差异代谢物在测试集 HCC VS NC, HCC VS Cir, S-HCC VS NC, and S-HCC VS Cir 这四组对比中众有显著差异，并且上下调趋势是否与训练集一致，从而在 17 个代谢物中筛选到了 8 个差异化合物。最后再结合二元 logistic 回归分析，筛选到一组标志物组合：Phe-Trp, GCA。
 

 
图 4 血清代谢物组（2-Meta）、AFP 和两者联合的 ROC 分析
 
在训练集和测试集中分别计算该标志物组区分肝细胞癌和肝硬化的 ROC，AUC 值分别达到 0.93 和 0.892，远远高于 AFP 的诊断能力。而如果与甲胎蛋白联用的话，则能表现出更高的诊断灵敏度。 另外测试集的数据也显示，在区分小肝细胞癌和肝硬化的时候，该标志物组相对于 AFP 有较高的诊断敏感度和相似的诊断特异性。而肝硬化是患小肝细胞癌的高危人群，在临床上很难鉴别，该标志物组的发现对于早期肝癌的发现具有显著意义。
 
验证集数据也与训练集测试集的结果类似，相比 AFP，该代谢物组表现出了较高的诊断能力。
 

图 5 血清代谢物组（2-Meta），AFP 和两者联合在 HCC 和 S-HCC 中的诊断性能比较
 
另外我们也可以看到，对于具有 HCC 和 S-HCC 的 AFP 假阴性（AFP <20 ng / mL）的患者，该组的诊断准确度能够大幅度提升。基于这些结果逐步鉴定并验证了 HCC 诊断的生物标志物。 
 
巢式队列研究
 

 
图 6 血清代谢物组（2-Meta），AFP 和两者联合在临床诊断前预测 HCC 的表现
 
验证队列 2 收录了 84 个样本，进一步评估代谢物组。标志物组的敏感度能达到 80%～70.3%，并且从 3 年前到 1 年前的数据可以看到，它对临床前 HCC 的诊断的敏感性是持上升趋势的。而与 AFP 结合使用的话，能够大幅度提升它的诊断特异性。 
 
关联分析
 

图 7 临床指标与代谢物的相关性分析
 
关联分析的结果可以看出，几种胆汁酸水平与天冬氨酸氨基转移酶，丙氨酸氨基转移酶，总胆红素，直接胆红素和间接胆红素水平呈正相关，与总蛋白和白蛋白水平呈负相关。Phe-Trp，5-羟色胺，肌醇，胆碱，牛磺酸等的水平则显示出相反的关系。而这些不同代谢物的水平与 BMI，AFP 水平，年龄和性别无关。 
 
结果与讨论
 
这项研究从多个中心招募了 1448 名受试者，对这些样本进行代谢组学 LC-MS/MS 检测，并结合多变量和单变量的统计分析，鉴定验证到了一组生物标志物：phe-trp 和 GCA，能够显著提升 HCC 的诊断敏感度和特异性。并且该生物标志物组可以识别 AFP 假阴性患者，并从高风险人群中区分患有 S-HCC 的患者，其诊断性能优于 AFP。本研究另一个独特的方面是巢式病例对照研究的验证。该标志物组随时间表现出的诊断敏感度增加趋势符合 HCC 的临床进展，并且敏感性和特异性与 AFP 互补，可在临床诊断前筛查来自高危人群的临床前 HCC。