重庆医科大学附属第一医院邓亮老师的课题组在 CLINICAL AND TRANSLATION MEDICINE 杂志上发表了研究论文 “Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression”, 研究了 Runx2 在肝星状细胞激活和肝纤维化中的作用。肝星状细胞(HSC)被认为是肝纤维化的潜在治疗靶点。转录因子 Runx2 与非酒精性脂肪性肝病的发展有关，在 HSC 激活和肝纤维化中的具体作用暂不清楚。在这项研究中，研究人员发现 Runx2 在不同病因的人类肝纤维化中显著上调，在小鼠的纤维化过程中也发现了类似的现象，并且其主要在活化的 HSC 中表达。研究人员通过构建一种在 HSC 细胞中特异敲除 Runx2 基因的小鼠，使用该小鼠进行肝纤维化诱导，可发现 HSC 特异敲除 Runx2 基因的小鼠可以显著的减轻被诱导小鼠的肝纤维化过程。进一步的研究发现 Runx2 可以促进 HSC 的活化和增殖，在 HSC 中敲除 Runx2 可以抑制这些作用。研究人员又通过 RNA-seq and ChIP-seq 技术，分析发现 Runx2 可以促进 Itgav 基因的表达而抑制 Itgav 则可以减弱 Runx2 诱导的 HSC 活化和肝纤维化。因此，此次研究确认了 Runx2 在肝纤维化过程中活化 HSC 的重要作用，它可能是肝纤维化研究和治疗的一个非常有潜力的靶点。 肝星状细胞(HSC)作为肝纤维化的关键环节，被认为是肝纤维化的潜在治疗靶点。已有研究表明，转录因子 Runx2 与非酒精性脂肪肝的发展有关，而其在 HSC 激活和肝纤维化中的具体作用仍然没有明确。
方法和结果
在这项研究中，研究人员发现 Runx2 的表达在不同病因所形成的人类肝纤维化中都显著上调。在纤维化过程中 Runx2 在小鼠肝脏中的表达也逐渐升高，并且 Runx2 主要在活化的 HSC 中表达。在 HSC 中 Runx2 的敲除显著减轻了 CCl₄, DDC or MCD 诱导的肝纤维化，而通过对小鼠的肝进行 HBAAV-Runx2 或 VA-Lip-Runx2 的注射过表达 Runx2 加剧了 CCl₄ 诱导的肝纤维变性。体外的分析表明 Runx2 促进了 HSC 的活化和增殖，而在 HSC 中敲低 Runx2 则抑制了这些作用。通过 RNA-seq 和 Runx2-ChIP-seq 的分析表明 Runx2 可以通过结合启动子来促进 Itgav 基因的表达。阻断 Itgav 则可减弱 Runx2 诱导的 HSC 活化和肝纤维化。此外，研究还发现细胞因子 TGF-β1, PDGF and EGF 可以通过蛋白激酶 A(PKA)来促进 HSC 中 Runx2 的表达和核转位。
结论转录因子 Runx2 在肝纤维化过程中通过转录调节 Itgav 的表达，对 HSC 的活化至关重要，它可能是肝纤维化的一个比较有前途的治疗靶点。1. 在肝纤维化进展的过程中 Runx2 的表达逐渐增加为了研究 Runx2 在肝纤维化中的作用，研究人员首先在 GEO 数据库中探索了 Runx2 的表达。在由不同病因引起的肝硬化患者中 Runx2 的表达要高得多，如酒精性肝病、病毒性肝炎和 NAFLD(图 1 A)。研究人员还发现 Runx2 的表达水平在晚期纤维化患者中较高，而在早期纤维化患者中较低，这表明 Runx2 的表达在肝纤维化的进展过程中会增加。接着，研究人员从非纤维化和肝硬化患者的身上收集人类肝组织，结果也显示 Runx2 的蛋白和 mRNA 水平在肝硬化患者的肝组织中显著上调(图 1 B and C)。组织学分析马松染色显示肝硬化组织中胶原严重沉积，同时 Runx2 and α-SMA(活化 HSC 的标志物)表达显著增加。在纤维索处 Runx2 也呈阳性染色(图 1 D)。在 GEO 数据库和 CCl₄ 引起的小鼠纤维化模型中，在纤维化的肝组织中也观察到了类似的 Runx2 表达上调的结果(图 1 E-H)。更重要的是，研究人员发现 Runx2 and α-SMA 在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关的肝纤维化中均显著增加(图 1 H)。

为了进一步研究 Runx2 在肝纤维化过程中的表达趋势，研究人员用 CCl₄ 处理小鼠 1 周和 6 周以诱导肝的损伤和纤维化，并监测 Runx2 的表达。研究发现，随着肝损伤的持续，胶原沉积逐渐增加，在受损肝脏中 α-SMA and Runx2 的表达轻度上调，但在纤维化肝脏中明显增加，这与 GEO 数据库的分析一致。有趣的是，组织学染色结果表明 Runx2 的阳性染色主要分布在肝组织的纤维索和间隔中，与 α-SMA 阳性细胞的分布一致(图 1 D and H)。总之，这些发现表明 Runx2 的表达在肝纤维化过程中逐渐增加，并在肝组织中表现出潜在的细胞特异性表达的特征。

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2. Runx2 在体内特异性定位于活化的 HSC 中，并在体外 HSC 活化的过程中以时间依赖性的方式增加表达

由于 Runx2 主要在肝间质细胞中表达，与 α-SMA 的表达一致，研究人员在纤维化的小鼠肝脏中用 α-SMA(活化的 HSC 标记物), CD31(内皮细胞标记物) 和 F4/80(库普弗细胞标志物)对 Runx2 进行共染，以评估 Runx2 在肝脏中表达空间的特异性。正如预测的那样，仅在 Runx2 和 α-SMA 之间观察到共表达的现象，这在人类肝硬化的肝组织中得到了进一步证实(图 2 A)。此外，通过比较静态的和从 CCl₄ 处理 4 周的小鼠中分离的活化的 HSC 之间的 Runx2 表达，发现活化 HSC 中 Runx2 的表达显著增加(图 2 B)。值得注意的是，单细胞 RNA 测序分析显示，与早期培养的原代 HSC 相比 Runx2 在肌成纤维细胞(分化良好的 HSC)中高度表达和分布，这与肌纤维细胞标记物(α-SMA and Col1a1)一致，这进一步支持 Runx2 主要存在于活化的 HSC 中(图 2 C)。最重要的是，在 HSC 的激活过程中 Runx2 的 mRNA 和蛋白表达以时间依赖性的方式进行上调，这与纤维化基因的表达有关，包括 α-SMA, collagen I and TGF-β1(图 2 D and E)。同时，研究人员还观察到 Runx2 在体外表现出过度的核转位并伴有 HSC 活化，这意味着 Runx2 同时开始了其转录功能(图 2 F)。总之，这些结果表明 Runx2 在活化的 HSC 中特异性表达，并可能在调节 HSC 活化中发挥作用。

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3. HSC 特异性敲低 Runx2 可以减轻 CCl4, DDC and MCD 诱导的小鼠肝纤维化为了确定 Runx2 在体内肝纤维化过程中的作用，研究人员首先使用慢病毒介导的 shRNA 在 CCl₄ 和橄榄油对照诱导的小鼠中敲低了 Runx2 数据表明敲低 Runx2 减轻了 CCl₄ 诱导的肝纤维化。接下来，研究人员又通过使用 PDGFRβ-Cre(HSC 特异性基因) 小鼠来构建出了 HSC 特异性敲除 Runx2 基因的小鼠。然而，纯合子(Runx2^ff;PDGFRα-Cre)在出生后立即死亡，因此 Runx2 半敲除的杂合子小鼠(Runx2^f+;PDGFRβ-Cre or Runx2^△+HSC)被用于进一步的体内研究(图 3 A)。结果表明，在 CCl₄ 诱导的纤维化组中 Runx2 的敲低降低了促纤维化基因，包括 TGF-β1, collagen I and α-SMA 的 mRNA 和蛋白水平的表达。尽管它们的 mRNA 表达水平在用橄榄油处理的 Runx2^△+HSC 小鼠中轻度下降，但这些基因的蛋白质水平没有显示出显著的变化(图 3 B and C)。此外，敲低 Runx2 在组织学上显著减轻了 CCl₄ 诱导的肝纤维化，减少了 I 型胶原的沉积和 HSC 的活化(图 3 D)。此外，研究人员还建立了DDC or MCD 诱导的肝纤维化小鼠模型，以评估 Runx2 在其他病因引起的肝纤维化中的作用。通过 H&E 染色证实 DDC 或 MCD 成功在小鼠中诱导了胆汁淤积症和 NASH, 另外，与对照组相比 Runx2 敲除小鼠的纤维化和 HSC 的激活水平都显著降低(图 3 E)。类似地 Runx2 的敲降也降低了 DDC and MCD 诱导的纤维化肝组织中 I 型胶原和 α-SMA 的 mRNA 和蛋白质的表达。此外，由于肝细胞(HC)损伤是肝纤维化的一个组成部分，研究人员通过使 Runx2^ff 小鼠与 Alb-Cre 小鼠来进行繁育也构建了 HC 特异性敲除 Runx2 的小鼠(Runx2^△/△HCs)来验证在 HC 中的 Runx2 敲除是否会影响肝纤维化的进展。不出所料 Runx2 的 HC 特异性敲除并不会影响 CCl₄ 诱导的肝纤维化。总之，这些发现表明 HSC 中 Runx2 的敲除减轻了 CCl₄, DDC and MCD 诱导的肝纤维化。

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4. Runx2 的过表达加剧了 CCl4 诱导的肝纤维化为了进一步证实 Runx2 在肝纤维化中的作用，研究人员通过注射 HBAAV-Runx2 三周来构建 Runx2 过表达小鼠，然后又用橄榄油和 CCl₄ 来处理小鼠 4 周(图 4 A)。随后，分离原代 HSC 和 HC 并检测 Runx2 基因 mRNA 的表达，以弄清过表达质粒在肝不同细胞群间的递送和表达效率。结果显示，与 HSC 相比，大多数 HBAAV-Runx2 被转染到了 HC 中。然而，由于 Runx2如前所述并没有影响 HC, 因此在某种程度上研究人员成功地构建了在 HSC 中过表达 Runx2 的小鼠。在使用 CCl₄ 处理后，结果发现，与对照组相比，在 HBAAV-Runx2 过表达小鼠中 Runx2, collagen I and α-SMA 的 mRNA 和蛋白的表达都显著增加(图 4 B and C)。在组织学上，与对照组相比，过表达 HBAAV-Runx2 组小鼠的肝脏结构表现出广泛的结构紊乱和相邻血管间显著的间隙(图 4 D)。在 HBAAV-Runx2 小鼠中 I 型胶原和 α-SMA 细胞的阳性染色也增加，表明纤维化严重，大量 HSC 被激活(图 4 D)。此外，研究人员发现在橄榄油处理的小鼠中 Runx2 的过表达触发了 GFAP 阳性细胞(静态 HSC)的增殖，但不影响胶原沉积, HSC 的活化, I 型胶原和 α-SMA 的 mRNA 和蛋白的表达(图 4 D)，这表明 Runx2 在 HSC 中的过表达不能触发自发纤维化或 HSC 活化。此外，研究发现，通过注射携带 Runx2(VA-Lip-Runx2) 或 VA-Lip-Ctrl 质粒的脂质体，在 HSC 中特异性过表达 Runx2 增强了 CCl₄ 诱导的小鼠肝纤维化。综上所述，这些结果表明 Runx2 的过表达会加剧 CCl₄ 诱导的肝纤维化。

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5. Runx2 在体外调节 HSC 的激活由于 Runx2^f/f 小鼠与 PDGFRβ-Cre 小鼠只能培育出 Runx2 半敲除的杂合子小鼠(Runx2^△/+HSC)；研究人员利用 GFAP-Cre(肝中 HSC 的另一种标记物)小鼠与 Runx2^f/f 小鼠杂交，成功获得 Runx2 敲除纯合子小鼠(Runx2^△/△HSC)(图 5 A)。考虑到 GFAP-Cre 也可以标记胆管细胞，所以 Runx2^△/△HSC 小鼠在本次研究中主要被用于进行体外实验。为了进一步评估 Runx2 在 HSC 激活中的作用，从 Runx2^△/△HSC 和 HBAAV-Runx2 小鼠中分离出原发性 HSC 并培养 4 天(图 5 B)。结果发现在 Runx2^△/△HSC 小鼠缺失 Runx2 基因的 HSC 中 HSC 标记基因和纤维化基因，如 desmin, α-SMA, Col1a1, Col3a1, MMP2, MMP9, MMP13, TIMP-1, TGF-β1 和 PDGFRβ 的 mRNA 表达都降低了(图 5 C)，并且 α-SMA, collagen I and TGF-β1 的蛋白表达也降低了(图 5 D)，然而在 Runx2 过表达小鼠的 HSC 中，纤维化基因如 α-SMA, collagen I and TGF-β1 的 mRNA 和蛋白的表达都提高了(图 5 E and F)。此外 Runx2 缺失抑制了 α-SMA 的表达，并在体外维持了 HSC 静态的表型(图 5 I)。接着，研究人员进一步使用小干扰 RNA 来敲低原代 HSC, LX2(人 HSC 细胞系)和 mHSC (小鼠 HSC 细胞系)中的 Runx2. 结果显示 Runx2 缺失降低了所有细胞中 α-SMA mRNA 的表达，而 Runx2 过表达上调了 mHSC 细胞中 α-SMA mRNA 的表达。此外，流式细胞分析的结果显示 Runx2 的敲除显著减少了 HSC 的 G2 期，表明 HSC 增殖受到抑制，但 Runx2 的过表达会持续导致 HSC 细胞 S 期的减少和 G2 期的增加，并显著促进了 HSC 在体外的生长(图 5 G)，这表明 Runx2 是 HSC 增殖的正向调节因子。总之，这些发现表明 Runx2 是 HSC 激活和增殖的重要转录因子。

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6 .Itgav 是 Runx2 在肝纤维化中的直接下游靶点为了探索 Runx2 调节 HSC 激活的潜在机制，研究人员通过使用转染了干扰 Runx2 表达的 siRNA 的原代 HSC 来进行 RNA 测序(RNA-seq)。根据 KEGG 富集分析的结果显示 Runx2 敲低主要与激活 HSC 的信号通路受损有关，包括凋亡、细胞周期、自噬、MAPK and TGF-β 信号通路(图 6 A)。由于 Runx2 在各种生物过程中起转录因子的作用，所以研究人员对来自 HBAAV-Runx2 小鼠的 HSC 又进行了染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析，以确定 Runx2 在活化的 HSC 中的直接靶点。结果显示 Runx2 与许多 DNA 序列有结合，其中许多峰位于靶基因的转录起始位点附近。根据 KEGG 分析发现 Runx2 结合的区域主要靠近 PI3K-Akt 信号通路、代谢通路、TGF-β 信号通路等相关基因(图 6 B)。进一步 RNA-seq and ChIP-seq 显示 Runx2 对 TGF-β 信号通路有显著影响。然而，包括 TGF-β1 在内的 TGF-β 配体并不是 Runx2 的直接下游因子，这表明 Runx2 可能通过不直接介导 TGF-β 配体的表达的方式来调节 TGF-β 信号通路。由于 TGF-β 信号通路是调节 HSC 活化和肝纤维化过程中最重要的通路之一，整合 TGF-β 通路相关基因转录组和 ChIP-seq 数据集，获得了 7 个常见基因，包括 Itgav, Thbs1, Lox, Src, Spry2, Smad7 和 Npnt(图 6 C)。其中 Itgav 基因编码了 αv 整合素的主要成分，而 αv 整合素是调节 TGF-β1 激活和肝纤维化进展的关键整合素，这表明 Runx2 可能是通过 Itgav 信号通路来激活 HSC 的。使用 ChIP-seq 分析发现 Runx2 与 Itgav 转录起始位点上游的 Chr2:8372357-83723806 结合，这种结合通过荧光素酶报告基因测定实验得到了证实(图 6 D and E)。此外，对来自 Runx2^△/△HSC, Runx2^△/+HSC 和 HBAAV-Runx2 小鼠的肝组织和原代 HSC 中 Itgav 基因的 mRNA 和蛋白表达进行了检查，结果表明 Runx2 缺乏或过表达在体外和体内降低或增加了 Itgav 的表达(图 6 F-I)。鉴于 Itgav 与 ECM 配体结合并激活下游激酶，包括 FAK and PI3K. 以及与 TGF-β1 相互作用以激活 TGF-β1 信号通路。因此，研究人员检测了来自 Runx2 敲除和过表达小鼠原代 HSC 中的磷酸化 FAK, PI3K and Smad2/3 的表达。结果表明，磷酸化 FAK, PI3K and Smad2/3 的表达在 Runx2 过表达的 HSC 中增强，而在 Runx2 敲除的 HSC 则降低(图 6 I)。总之，我们的研究结果强烈表明 Runx2 通过与 Itgav 启动子结合来直接上调 Itgav 的表达，并激活潜在的信号转导，这反过来又有助于 HSC 的激活和肝纤维化的进展。同时，相关分析显示 Runx2 与 Itgav (r=.98), TGF-β1(r=.91) 和 collagen I(r=.97)高度相关。且 Itgav 也与 TGF-β2(r=.87) and collagen I(r=0.94)高度相关。这些结果表明，这些基因之间可能存在一些功能关系，它们可能共同调节或参与相似的生物通路。

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7 .抑制 αv 整合素阻断了 Runx2 过表达引起的 CCl₄ 诱导的肝纤维化加重为了探索 Itgav 在 Runx2 相关 HSC 激活和肝纤维化中的作用，研究人员首先通过在从HBAAV-ctrl 和 HBAAV-Runx2 小鼠中分离出的原代 HSC 中使用小干扰 RNA 来沉默 Itgav 基因，结构显示 Itgav 敲低显著阻断了 Runx2 过表达诱导的 α-SMA 上调。由于 Itgav 编码的整合素 α-V 链是五种 αV 整合素的主要成分，其表达变化将影响所有五种 αV 整合素的功能，因此，研究人员进一步利用 αv 整合素的小分子抑制剂(CWHM-12)来确定 Itgav 介导的 αv 整合素功能是否确实在 HSC 激活和肝纤维化进展中处于 Runx2 调节的下游(图 7 A)。结果发现 αv 整合素抑制显著阻断了 Runx2 过表达引起的 α-SMA 上调，这与 siItgav 相似(图 7 B and C)。然后，给 HBAAV-Runx2 或 HBAAV-ctrl 小鼠注射 CCl₄ 诱导 2 周以构建肝纤维化，然后再给药 CWHM-12 或 DMSO 处理 2 周(图 7 D)。结果显示 CWHM-12 显著降低了 α-SMA 的 mRNA 和蛋白质表达，并阻断了 Runx2 诱导的 α-SMA 表达上调，这与体外数据一致(图 7 E and F)。在组织学检测中，通过胶原沉积(Masson and collagen I 染色)和 α-SMA 染色检测显示 CWHM-12 显著减少了肝纤维化，重要的是抑制 αv 整合素显著阻断了 Runx2 加重的肝纤维化(图 7 G)。研究人员还通过在小鼠中同步静脉注射携带 Itgav siRNA 的脂质体(VA-Lip-siItgav) 和 VA-Lip-Runx2 来特异性阻断 Itgav 在 HSC 中的表达，以避免 CWHM-12 可能潜在的副作用，结果显示 siItgav 也显著抑制了 Runx2 促进的肝纤维化。因此，研究结果表明 Runx2 主要通过 Itgav 激活 HSC 并促进肝纤维化。

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8 .在 HSC 中 Runx2 的激活和核转位受 PKA 的调节Runx2 从细胞质到细胞核的易位是其转录活性所必需的。因此，研究人员也试图找出提高 Runx2 表达并控制其易位进入细胞核的上游调节信号。研究表明，蛋白激酶 A(PKA)激活 Runx2 并在肠上皮细胞的上皮-间质转化和成骨细胞分化过程中介导其核转位。此外 PKA 也是 PDGF, EGF 和 TGF-β1 的常见下游激酶，它们是调节 HSC 激活的必需细胞因子。因此，研究人员利用 TGF-β1, PDGF-BB 或 EGF 来激活使用或不用 PKA 抑制剂(PKI-6-22)处理的原代 HSC 细胞。结果显示 TGF-β1, PDGF-BB 和 EGF 都显著增加了 Runx2 的表达，而 PKA 抑制剂则消除了这效应(图 8 A)。此外 Runx2 可以激活 Itgav 的转录，因此也检测了 PKA 对 Itgav 的影响。结果显示 TGF-β1, PDGF-BB 和 EGF 显著增加了 Itgav 的表达，但所有这些也都被 PKA 抑制剂消除了(图 8 A)。此外，研究还发现 PKA 激活剂(8-Bromo-cAMP)可以刺激 Runx2 在 HSC 中的核分布。相反 PKA 抑制剂在有或没有 TGF-β1 培养的 HSC 中减弱了 Runx2 的核转位(图 8 B)。免疫荧光染色还表明，用 PKA 抑制剂处理的 HSC 导致了细胞核中 Runx2 的表达受到了抑制，使得 HSC 表型保持更加静止，而 PKA 激活剂诱导了 Runx2 在细胞核中的分布更高并且使得 HSC 活化(图 8 C)。总之，这些发现表明 TGF-β1, PDGF-BB 或 EGF 通过 PKA 激活 Runx2 并促进其核转位。 本研究中所使用的 Runx2 CKO 条敲小鼠由北京唯尚立德提供，该小鼠是在 C57BL/6 的背景下通过 CRISPR/Cas 9 技术构建而成的。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验，已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型，同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台，欢迎您致电咨询。