（In situ cell death detection kit-POD法）

一、 原理：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、 器材与试剂

器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；

试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

三、 实验步骤

操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。

具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：

1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；

注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理

4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；

5. PBS漂洗2次；

6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。

7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

8. PBS漂洗3次；

9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；

10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

11. PBS漂洗3次；

12. 在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；

13. PBS漂洗3次；

14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）

对于.培养细胞的预处理：
①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；
③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；
④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100（见备注5）中处理5min；
⑥PBS浸洗二次，每次5min；

后续操作如同石蜡包埋切片的6—15

四、 注意事项

1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。

2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。

3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。

6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴 &比& 妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。

7. 荧光素标记的dUTP液含甲次酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。

8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。

9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。