免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）最初是作为一种传统的亲和柱层析适应不同需求而被开发使用的。亲和柱层析包括能够允许样品、洗涤液和其他溶液通过的多孔树脂，通常树脂上已经固定了目标蛋白的特异性抗体。然而，免疫沉淀采用的不是亲和柱层析所需的填料柱，而是在离心管中使用少量的树脂通过间隔的孵育方式最后在底部沉淀中得到结合在树脂上的蛋白，用于后续的蛋白洗脱或者 SDS-PAGE 以及 WB 鉴定。
 

免疫沉淀实验样品通常有以下几种：含有标签的纯化后重组蛋白、过表达带标签蛋白的细胞裂解液、细胞或组织裂解液等。前者通常需要使用标签抗体，后者则通常使用蛋白本身的抗体进行内源性 IP 实验。目前常用的标签主要有以下这些：

● FLAG; peptide sequence DYKDDDDK
● c-Myc; peptide sequence EQKLISEEDL
● Hemagglutinin (HA); peptide sequence YPYDVPDYA
● V5; peptide sequence GKPIPNPLLGLDST 
● Green fluorescent protein (GFP)
 

华安现有多种标签抗体用于 IP 实验，其中 Flag 抗体（M1403-2）和羊驼抗 GFP 抗体 NBbiolab（NBS01A），实验数据如下。
 

Immunoprecipitation of GFP protein with GFP Nanoselector Agarose.
 

Immunoprecipitating DYKDDDDK Tag(FLAG)(M1403-2) and IgG in recombinant protein with flag on N-terminal. 

Lane1:Control is recombinant protein with flag on N-terminal
Lane2:Immunoprecipitating IgG in recombinant protein with flag on N-terminal
Lane3:Immunoprecipitating FLAG in recombinant protein with flag on N-terminal
 

免疫沉淀是众多生物实验中相对具有挑战性的实验，我们为广大客户提供了一份简单的细胞 IP 实验操作流程。IP 实验所需的材料主要是 lysis buffer，配方为 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml aprotinin, 1 mM Na3PO4,1 mM PMSF, 5 mM NaF, 3 mM Na4P2O4。
 

具体实验流程如下：
 

一、裂解细胞

1. 配置细胞裂解液

2. 清洗：长满 10 cm 培养皿的细胞去除培养基后使用 1×PBS 轻轻润洗细胞 3 遍；

3. 裂解：加入 1 ml lysis buffer，冰上静置 2 mins 后用细胞刮收集细胞至 EP 管中；然后放到 4℃ 垂直转子上，旋转 20 mins 保证细胞裂解完全。

4. 离心：裂解完全后离心，4℃，12000rpm，10 mins；

5. 静置：吸取上清至新的 EP 管中，置于冰上；

 

二、平衡 Beads

1. 混匀：吸取 15-25 μl beads（protein A/G agarose resin）至 1.5 ml EP 管中，并且使用 1 ml lysis buffer 清洗 beads；

2. 离心：4℃，离心，100 g , 5 mins;

3. 弃掉上清；

4.   以上步骤重复 2-3 遍。

 

三、蛋白结合

孵育：将平衡后的 beads 加入裂解液上清中，同时加入 1-2ug 目标抗体（如过表达 Flag 标签 A 蛋白则使用 Flag 抗体），放到 4℃ 垂直转子旋转充分孵育 3 h；

 

四、洗涤

1. 离心：孵育结束后离心，4℃，100 g，3 mins；

2. 洗涤：弃去上清（注意不要吸走 beads），加入 500μl lysis buffer，垂直转子慢速上下颠倒清洗 3 mins，

3. 离心：4℃ 离心，100 g，5 mins，然后弃去上清；

4. 重复步骤 2&3 两次 (总共洗三遍)；

5. 变性：离心后弃去上清（尽可能吸走上清液），加入 50μl 1×loading buffer，95℃，煮 5 mins；

6. 离心：冰上冷却, 室温离心，1200rpm，3 mins；

7. 进行后续检测实验；

 

在免疫沉淀实验后续的 WB 实验中，可以使用常规的 Anti-IgG (H+L) 二抗进行曝光。
 

需要注意的是，WB 实验曝光时会出现 IP 过程中加入的抗体所产生的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在这两个位置附近时，就会受到这两条带的干扰。华安同时拥有 IP 纳米二抗，消除重轻链影响。数据如下：
 

Immunoprecipitating IgG and DYKDDDDK Tag (FLAG)(M1403-2) in recombinant protein with flag on N-terminal.

Lane1/2: Immunoprecipitating IgG in recombinant protein with flag on N-terminal
Lane3: Immunoprecipitating DYKDDDDK Tag (FLAG) (M1403-2) in recombinant protein with flag on N-terminal