在未涉及正文分析介绍及阐述之前，首先给大家分享一个关于斑马鱼研究的框架图：


 

从框架图可以看出，该研究的目的及主要思路是：评估 Ziram 对斑马鱼发育的影响，主要从形态学、行为、生理学和分子四大方面来进行探讨。毋庸置疑，这也是今天将与大家分享的一篇使用Noldus（诺达思）的 DanioVision(斑马鱼行为轨迹跟踪系统)进行斑马鱼研究与分析的文章，发表于 2018 年 9 月。研究着重强调以下几点：

1. 探讨了 Ziram 杀菌剂的毒性对斑马鱼胚胎发育的影响；

2. 测量了线粒体生物能量学、幼鱼行为和基因表达；

3. 当 Ziram 浓度>100nM 时, 会引起致命性、发育性缺陷和脊索畸形；

4. 暴露于亚致死剂量 1nM 和 10nM 7 天之后，幼鱼行为开始发生变化。

 

01|关于 Ziram

Ziram 是一种广谱农药\杀虫剂，化学上称之为：二甲基二硫代氨基甲酸锌 (Houeto et al., 1995; Kanchi et al., 2014)，可用作杀虫剂或杀菌剂。1960 年首次在美国注册，用于控制苹果和梨子的黑星病、桃子的卷叶病、西红柿的炭疽病和早疾病 (US EPA, 2004)。

Ziram 与环境和人类健康密切相关，这就需要进一步研究其在非靶标生物和人类中的毒性及作用机制。譬如，流行性病学研究表明，单独使用 Ziram 或与其它农药结合起来使用后，与神经退行性疾病相关，如帕金森疾病 (Fitzmaurice et al., 2014; Rhodes et al., 2013; Wang et al., 2011)。Ziram 吞食有害、吸入有高毒性、刺激呼吸系统、对眼睛有严重伤害，对水生生物有极高的毒性，可能对水体环境产生长期不良影响。

因此，量化 Ziram 这类杀菌剂的负面影响，有利于更好地掌握它们与神经性退行疾病之间的关系，从而更好地对毒理、药理进行研究。

02|斑马鱼作为模式动物的优势

斑马鱼是评估神经毒性及神经行为毒性的模式动物，因为它是发展很迅速的脊椎动物，有良好的神经递质系统 (Panula et al., 2010)，此外，斑马鱼早期生长阶段对环境污染和药物比较敏感 (Jin et al., 2009; Schulz et al., 2010)。

斑马鱼基因与人类基因的相似度达到 87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体；再加上其胚胎是透明的，更容易观察到药物对其体内器官的影响。

已有研究探讨过 Ziram 对斑马鱼幼鱼行为的影响 (Lulla et al., 2016)。但研究的具体内容和深度与本研究不同，本研究是从深度、广度两方面将 Ziram 对斑马鱼胚胎发育的影响诠释的淋漓尽致。

03|主要研究结果

斑马鱼行为轨迹跟踪系统 (DanioVision) 是一个完整解决方案，由 DanioVision 观察箱、温控模块， 以及预装于计算机的 EthoVision XT 组成。该系统是用于斑马鱼或其他极小型动物高通量追踪 的创新系统。借助 Noldus 的动物运动轨迹跟踪系统可同时在多孔板高精度追踪多达 96 只动物。

本研究就是使用了该系统，通过 96 孔板对斑马鱼在光区、暗区的活动及行为进行观察和分析，再结合其他分析工具和方法，最终得到研究结果。

表 1为在 96 h 之后斑马鱼胚胎中 Ziram 的 LC₅₀值，从表 1 数据结果，我们可以看出 96 h 时 LC₅₀ 为 1082.54（相当于 0.33 mg/L），表明 Ziram 对斑马鱼胚胎具有较高的毒性。





 

图 1为 96 h 之后 Ziram 引起的斑马鱼胚胎的死亡率和发育障碍情况。其中A为受精 24,48,72 和 96 h 胚胎的累计死亡率；B为受精 72 和 96 h 胚胎的累计孵化率；C为受精 48,72 和 96 h 胚胎 20s 内的心跳；D为受精 48,72 和 96 h 胚胎的脊索畸变率。从图 1 可以看出：

1、斑马鱼受精 96 h 时对照组与 Ziram 浓度为 1nM 和 10nM 条件下的死亡率、孵化率、心跳和脊索畸变率无明显差异。相反地，Ziram 浓度为 100nM 和 1000nM 时，对照组与实验组在这些方面有明显差异。

2、Ziram 浓度为 100nM，斑马鱼受精 72 h 和 96 h 时，对照组与实验组的累计死亡率有显著差异（图 1A）；此外，Ziram 浓度为 1000nM，斑马鱼受精 24 h 时，对照组与实验组的累计死亡率也有显著差异（图 1A）。

3、与对照组相比，Ziram 浓度为 100nM、1000nM，斑马鱼受精 72 h 和 96 h 时，累计孵化率显著下降（图 1B）。在最高剂量 1000nM 条件下，实验组累计孵化率要比对照组少 4 倍左右。同时还评估了斑马鱼在受精 48,72 和 96 h 时的心跳（图 1C）。Ziram 浓度为 100nM、1000nM，斑马鱼受精 48 h,72 h 和 96 h 时, 与对照组相比，心跳显著减少（图 1C）。Ziram 浓度为 100nM、1000nM，脊索畸变率随着时间的增加而上升（图 1D）。

 

图 2为斑马鱼受精 72 h 和 96 h，Ziram 浓度为 100nM、1000nM 代表性图片。A 和 D（对照组）；B 和 E（100nM Ziram）、C 和 F 为实验组（1000nM Ziram）。从图 2 可得知：

斑马鱼受精受精 72 h 和 96 h 时，Ziram 浓度为 100nM、1000nMZiram，有严重的脊索畸变（图 2）, 红色箭头为畸变的具体位置，实验组斑马鱼脊索严重扭曲。
 

 

图 3为斑马鱼幼鱼在 Ziram 浓度为 10nM 时的行为反应（7 天观察）。A为 60 min 内的总活动；B为 60 min 内的运动速度；C为 60 min 内光区与暗区的运动距离；D 为 60 min 内光区与暗区的运动速度；E 为每 15 min 移动的总距离；F 为在暗区的平均时间；G为每 15 min 在暗区的频率；H 为每 15 min 在暗区的累计时间。

研究对不同胚胎使用相同剂量进行了实验。实验结果表明，与对照组相比，Ziram 浓度为 10nM 时, 实验组的斑马鱼幼鱼活动显著增加。（图 3A）；斑马鱼幼鱼在光区的移动速度显著提高（图 3D）；总活动距离在第二个 15 min 显著增多（图 3E）。

相反地，与对照组相比， 1nM、10nM Ziram 浓度导致斑马鱼幼鱼在暗区的第二个 15 min 的平均时间明显减少；但光/暗区的总速度、距离，暗区运动速度、频率、累计时间方面没有发生显著变化（图 3B、C、D、G、H）。

以上便是给大家介绍的该研究的主要研究结果（其它研究结果可联系我们获取相关文献进一步了解），从上述内容可以看出，Ziram 对斑马鱼的影响是极其深远的（从形态学方面到具体的行为活动反应）。一句话概括来说就是：Ziram 的毒性对斑马鱼胚胎发育有负面影响，具体体现如上文详细阐述的内容。

该研究结果进一步验证了以往的研究结果，丰富了斑马鱼研究领域的内容，为斑马鱼进一步研究开拓了新的思路。

参考文献

1. Fangjie Cao, Christopher L. Souders II, Pengfei Li,Ondrej Adamovsky, Sen Pang, Lihong Qiu,Christopher J. Martyniuk.,2018.Developmental toxicity of the fungicide ziram in zebrafish.

2. Fitzmaurice, A.G., Rhodes, S.L., Cockburn, M., Ritz, B.,Bronstein, J.M., 2014. Aldehyde dehydrogenase variation enhances effect ofpesticides associated with Parkin-son disease. Neurology 82, 419e426.

3. Houeto, P., Bindoula, G., Hoffman, J.R., 1995.Ethylenebisdithiocarbamates and ethylenethiourea: possible human healthhazards. Environ. Health Perspect. 103, 568e573.

4. Jin, Y., Chen, R., Sun, L., Qian, H., Liu, W., Fu, Z.,2009. Induction of estrogen-responsive gene transcription in the embryo, larval,juvenile and adult life stages of zebrafish as biomarkers of short-term exposureto endocrine dis-rupting chemicals. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol.Pharmacol. 150, 414e420.

5. Lulla, A., Barnhill, L., Bitan, G., Ivanova, M.I.,Nguyen, B., O’donnell, K., Stahl, M.C., Yamashiro, C., Klarner, F.G., Schrader,T., Sagasti, A., Bronstein, J.M., 2016. Neurotoxicity of the Parkinsondisease-associated pesticide ziram is synuclein-dependent in zebrafish embryos.Environ. Health Perspect. 124, 1766e1775.

6. Panula, P., Chen, Y.C., Priyadarshini, M., Kudo, H.,Semenova, S., Sundvik, M., Sallinen, V., 2010. The comparative neuroanatomy andneurochemistry of zebrafish CNS systems of relevance to human neuropsychiatricdiseases. Neu-robiol. Dis. 40, 46e57.

7. Rhodes, S.L., Fitzmaurice, A.G., Cockburn, M., Bronstein,J.M., Sinsheimer, J.S., Ritz, B., 2013. Pesticides that inhibit theubiquitin-proteasome system: effect measure modification by genetic variation inSKP1 in Parkinsons disease. Environ. Res. 126, 1e8.

8. Schulz, R.W., de Franca, L.R., Lareyre, J.J., Le Gac, F.,Chiarini-Garcia, H., Nobrega, R.H., Miura, T., 2010. Spermatogenesis in fish.Gen. Comp. Endocrinol. 165, 390e411.

9. Wang, A., Costello, S., Cockburn, M., Zhang, X.,Bronstein, J., Ritz, B., 2011. Parkinson’s disease risk from ambient exposureto pesticides. Eur. J. Epidemiol. 26, 547e555.