环状RNA（circRNA）是一种环状内源性RNA，通过特殊的选择性剪接产生，参与多种疾病的进展。然而，circRNA在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中的作用仍鲜有报道。因此，小编和大家分享最近发表在Molecuar Cancer上的文章“Circ-AKT3 inhibits clear cell renal cell carcinoma metastasis via altering miR-296-3p/E-cadherin signals”，从而了解Circ-AKT3在透明细胞肾细胞癌转移中的作用。

   我们使用环状RNA芯片检测ccRCC中circ-AKT3的低表达。然后，应用qPCR芯片检测60例ccRCC组织及邻近正常组织中circ-AKT3的表达情况，以及在ccRCC细胞系和人正常肾细胞（HK-2）的表达情况。另外，我们在体内外研究了circ-AKT3在ccRCC中的作用，并通过Western blotting、生物信息学分析、RNA下拉实验和荧光素酶报告基因实验检测其作用机制。
结果：
1、Circ-AKT3在ccRCC中稳定低表达
首先研究circRNA在ccRCC中的表达情况，我们使用circRNA芯片分析了3对与癌旁正常组织配对的ccRCC组织样本（图1a）。在ccRCC组织中总共有53个circRNA被显著上调，30个circRNA被下调(图1b)。然后，我们选择了10个最显著的高表达和低表达circRNA来验证它们在ccRCC组织样本和细胞系中的丰度。与正常肾组织相比，ccRCC组织中AKT3基因位点明显降低，这与circRNA芯片结果一致（图1d-e）。此外，circ-AKT3在人类ccRCC细胞系中表达下调（图1f）。通过RNase处理和qPCR检测，结果表明circ-AKT3呈环状，在细胞内稳定表达（图1g）。


2、Circ-AKT3在ccRCC细胞的迁移和侵袭过程中起抑制作用
   为了探索circ-AKT3在ccRCC中的作用，我们使用了三种siRNA寡核苷酸来定位这个circRNA独特的反向剪接连接。反义剪接连接的siRNAs可显著降低circ-AKT3的表达，而线性AKT3 mRNA水平未见下降（图2a）。利用Geneseed合成circ-AKT3过表达慢病毒质粒，利用qRT-PCR检测其转染效率（图2b）。在敲低circ-AKT3后，OSRC-2细胞在伤口愈合实验中显示出增强的迁移能力，反之亦然（图2c）。Transwell试验进一步证明了沉默circ-AKT3显著促进了OSRC-2细胞的迁移和侵袭（图2d，e）。与此同时，过度的circ-AKT3显著抑制SW839细胞的迁移和侵袭（图2f，h）。综上所述，circ-AKT3通过抑制ccRCC细胞的迁移和侵袭而起到保护作用。


3、Circ-AKT3通过恢复E-cadherin的表达来抑制ccRCC的迁移和侵袭
   为了检测circ-AKT3在ccRCC中的具体作用机制，我们将研究重点放在了ccRCC转移相关的基因上。其中，Western blot结果显示，与转移相关的基因E-cadherin明显受circ-AKT3调控（图3a）。之前有研究表明，E-cadherin在ccRCC转移中发挥关键的保护作用。通过对TCGA数据库的分析，肿瘤组织中E-cadherin的mRNA水平较癌旁组织大多数下调（图3b，c）。


4、miR-296-3p被circ-AKT3吸收，在ccRCC转移中起积极作用
   由于circRNA的功能主要是作为miRNA的海绵调节下游基因，我们接下来探讨了circ-AKT3与miRNA结合的能力。使用在线生物信息学数据库寻找靶向E-cadherin mRNA的潜在miRNA，并作为circ-AKT3海绵，预测了4种miRNA（miR-330- 3p、miR-296-3p、miR-382-5p和miR-326）（图3d）。结果表明，miR-296-3p、miR-382-5p和miR-326均被circ-AKT3海绵化（图3e，f）。
   随后，我们基于TCGA数据库分析miR- 296-3p、miR-382-5p和miR-326在配对的ccRCC组织中的表达水平。结果显示，miR- 296-3p在配对和未配对的ccRCC组织中表达增加（图4a）。然而，miR-382-5p在ccRCC组织中表达下降（图4b），而miR-326在ccRCC组织与邻近正常组织中无显著差异（图4c）。Transwell实验被用来确定miRNA在ccRCC转移中的作用。结果表明，只有miR-296-3p促进了ccRCC细胞的迁移（图4d-g），而其他两个miRNA对ccRCC细胞的迁移没有影响。因此，这些结果表明，miR-296-3p在ccRCC细胞的转移中发挥了积极作用，circ-AKT3充当了miR-296-3p的海绵。


5、miR-296-3p介导circ-AKT3依赖性的E-cadherin表达和细胞迁移侵袭
   为了研究circ- AKT3与miR-296-3p在ccRCC细胞中的功能相互作用，我们使用Transwell实验进行了挽救实验。我们发现，miR-296-3p模拟物促进了OSRC-2细胞的迁移和侵袭，可以通过添加circ- AKT3来挽救（图5a，b）。此外，miR-296-3p模拟物显著抑制了E-cadherin的表达，而转染circ-AKT3过表达质粒后，这种作用可以逆转（图5c）。在SW839细胞中重复进行Transwell分析和western blotting分析，结果与OSRC-2细胞一致（图5d-f）。
   为了确定预测的circ-AKT3序列中miR-296-3p结合位点是否对其相互作用至关重要，我们将预测结合位点中circ-AKT3的野生型和突变序列插入荧光素酶报告载体pmirGLO中（图5g）。结果表明，转染野生型序列的OSRC-2和SW839细胞的荧光素酶活性显著降低，而转染突变型序列的细胞与对照组相比没有差异（图5h）。这些数据表明，circ-AKT3可能通过预测的结合位点作为miR-296-3p的海绵。接下来，为了确定miR-296-3p是否可以与E-cadherin mRNA 3’-UTR结合，我们构建了含野生型Ecadherin 3'-UTR和具有潜在位点突变的3 '-UTR的报告质粒（图5i）。如图5j所示，miR-296-3p模拟物可降低转染含有野生型E-cadherin mRNA 3’-UTR序列质粒的细胞的荧光素酶活性，而转染miR-296-3p结合位点突变的组未见此效应，表明miR-296-3p直接在预测的结合位点与E-cadherin mRNA的3’-UTR结合。综上所述， circ-AKT3通过充当miR-296-3p的海绵，在一定程度上抑制了E-cadherin mRNA的降解，从而抑制了细胞的迁移和侵袭。


6、circ-AKT3的修复抑制了ccRCC的体内转移
   进一步的体内研究是为了确定circ-AKT3的强制表达对ccRCC转移的调节作用。将稳定表达荧光素酶的细胞感染circ-AKT3过表达慢病毒，经puromycin筛选后，将OSRC- 2-luciferase-circ-AKT3或OSRC-2-luciferase-vector细胞注射到BALB/c裸小鼠肾包膜下。与载体组相比，注射过表达circ-AKT3细胞的裸鼠转移灶较少（图6a-d）。此外，与对照组相比，OE-circ-AKT3组的E-cadherin表达水平明显上调（图6e）。免疫组化结果显示，与对照组相比，在OE-circ-AKT3肿瘤中，E-cadherin表达明显增强。综上所述，这些结果表明circ-AKT3的强制表达能够有效抑制ccRCC在体内的转移。

结论:
   Circ-AKT3通过竞争性结合miR-296-3p来抑制E-cadherin的表达，从而抑制ccRCC的转移。因此，Circ-AKT3可以作为一种新的治疗手段，更好地抑制ccRCC的转移。