作为高等生物中常见的RNA修饰方式，m6A修饰不但可以修饰mRNA，也可以修饰一些非编码RNA，参与多种生物学过程，因此备受科研工作者的瞩目。近日，一篇发表在nature communications上面的文章引起小编的注意，与大家一起来看下circRNA的m6A修饰所带来的神奇效应。

思维路线：


结果:
1.CircNSUN2在结肠癌（CRC）肝转移（LM）中上调
   circNSUN2源自NOP2 / Sun RNA甲基转移酶家族成员2（NSUN2）基因座的第4和5外显子区域，高表达circNSUN2的CRC患者总生存期（OS）较差，circNSUN2在原发性CRC，尤其是在带LM的CRC中中常上调表达。值得注意的是，与没有LM的CRC患者相比，circNSUN2在有LM的CRC血清中明显上调。


2.CRC中circNSUN2的特征
   circNSUN2由外显子5至外显子4环化形成的， 转录抑制剂actinomycin d处理后，circNSUN2的半衰期超过24小时，而相关的线性转录本大约4小时，表明circNSUN2在CRC细胞中更稳定。circNSUN2主要位于细胞质中，但也出现在细胞核中。


3.CircNSUN2在PDX模型中促进CRC细胞转移
   构建敲低或过表达circNSUN2的TC71 PDX CRC细胞，在PDX CRC中敲除circNSUN2后，肿瘤肝脏或肺转移明显受到抑制，过表达circNUSN2的TC71细胞肝脏或肺中转移结节增加。


4.YTHDC1促进m6A修饰的circNSUN2的细胞质输出
   探索circNSUN2在调节CRC恶性肿瘤中潜在的分子机制，筛选circNSUN2相互作用蛋白发现YTHDC1和IGF2BP2是circNSUN2结合蛋白，circNSUN2可以用YTHDC1抗体沉淀，由于YTHDC1是一种m6A读码器，探索circNSUN2上是否有m6A甲基化，发现circNSUN2的外显子5−exon 4结合区域在m6A沉淀片段高度富集，确认circNSUN2中的m6A修饰。YTHDC1的沉默增加了核circRNA含量，相比于m6A结合缺陷型YTHDC1，野生型YTHDC1的强制表达，挽救了YTHDC1耗尽引起circNSUN2的细胞质输出缺陷。YTHDC1可以结合circNSUN2，并因此以m6A依赖性方式促进circNSUN2从细胞核输出到细胞质。


5.CircNSUN2通过CAUCAU与IGF2BP2相互作用
   circNSUN2能被IGF2BP2蛋白拉下来，在细胞质中可看到circNSUN2和IGF2BP2的共定位。截短单个KH域构建IGF2BP2突变体，发现IGF2BP2的KH3-4双结构域特异性地绑定到circNSUN2，表明KH3-4双域负责招募circNSUN2。位于circNSUN2外显子5-外显子4交界处的CAUCAU基序是IGF2BP2的结合基序，是IGNS2BP2相互作用所必须的。当IGF2BP2蛋白的浓度为增加，circNSUN2 / IGF2BP2混合物的浓度也增加，CAUCAU基序的突变可明显降低混合物的浓度。


6.CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2复合物可稳定HMGA2 mRNA
   数据分析和实验验证确定了HMGA2是circNSUN2的靶标，敲除circNSUN2会降低HMGA2 mRNA的稳定性，HMGA244的下游靶标CXCR4的表达也被下调，circNSUN2的过表达有效上调HMGA2和CXCR4的表达。因为HMGA2可诱导EMT并促进结肠癌进展，进一步评估circNSUN2是否可以增强CRC细胞的EMT表型。circNSUN2的过表达导致上皮标志物E-cadherin的表达下调，间质标记物波形蛋白的表达上调，提示circNSUN2通过HMGA2途径促进CRC细胞中的EMT。构建野生型HMGA2-3'UTR（HMGA2-WT）或突变型3'UTR（HMGA2-Mut）荧光素酶报道基因，HMGA2-Mut中与circNSUN2交互所需的TGTTT基序已被替换。发现HMGA2-Mut的荧光素酶活性比HMGA2-Mut低一半，敲低circNSUN2抑制了HMGA2-WT的荧光素酶mRNA表达和荧光素酶活性，但HMGA2-Mut没有被抑制。HMGA2和IGF2BP2共定位在细胞质中，在circNSUN2缺失时，HMGA2 / IGF2BP2 RNA蛋白复合物减少，IGF2BP2表达保持不变。circNSUN2和HMGA2的相互作用需要IGF2BP2的 KH3-4双结构域。敲低circNSUN2显着降低HMGA2 / IGF2BP2 RNA-蛋白质相互作用，circNSUN2的过表达显着增加了IGF2BP2免疫沉淀组分中HMGA2的富集。这些发现证明circNSUN2在促进IGF2BP2和HMGA2相互作用中起关键作用，并增强的HMGA2 mRNA稳定性，通过形成circNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2 RNA-蛋白三元复合物。



7.CircNSUN2通过HMGA2途径促进CRC的LM
   体内模型显示circNSUN2敲低的 PDX CRC细胞引起的肝转移性结节减少，可被HMGA2过表达修复，HMGA2过表达可有效抑制沉默circ NSUN2所引起的细胞侵袭迁移减少。HMGA2和CXCR4的表达水平与circNSUN2转录本水平为正相关，HMGA2和CXCR4的表达水平预示CRC患者较差的OS。circNSUN2提供潜在的治疗目标，拓宽人类CRC的治疗选择。