tRNA-derived small RNA (tsRNA)是一种新型的调节性非编码小RNA，参与多种生理和病理过程。然而，外泌体中tsRNAs的存在及其诊断潜力仍不清楚。在此背景下，作者做了高通量测序进行研究，于今年4月发表在molecular cancer（IF：10.679）杂志上。
主要结果：
1、细胞培养基中外泌体tsRNAs的检测与验证
   为了全面分析外泌体tsRNAs，从SK-Hep1肝癌细胞培养液中分离出外泌体，并制备小型RNA-seq文库用于高通量测序(图1a)。制备的外泌体经透射电镜(TEM)、Western blot分析(外泌体蛋白标记物CD63和非外泌体标记物Calnexin)及粒径(3-100 nm)确证。进行了两次外泌体小RNA测序，重复性高(图1 c)。5%的外泌体小RNA来自于tRNAs，提示tsRNAs可以被整合到外泌体中并分泌到细胞外环境中(图1d)。如图1e所示，tRNA-5是外泌体中最丰富的tsRNA，占90%，而tRNA-3和tRNA-i分别占9和1%。各类型tsRNA的分布存在明显的偏倚，其中tRNA-5s的长度大部分在32~33 nt之间，而tRNA-3s的长度主要为16-18 nt, tRNA-i有两个峰(16-17 nt和28-32 nt) (图1g)。分析外泌体tsRNAs的来源发现97%的tRNA-5s来自于4个tRNAs(Gly-， Glu-， Lys-，Val- tRNA)(图1f)。Gly-tRNA的tRNA-5s以32 nt为主，而Lys-和的tRNA-5s以32 nt为主Val- tRNA的长度为33 nt(图1h)，说明tsRNAs不是随机降解的产物，而是由未知的机制产生的。另外，52%的tRNA-5和32%的RNA-is主要来源于Gly-tRNA(图1f)，而tRNA-3s几乎由四种不同的tRNA (Ala-、Asp-、Glu-和Val-tRNA)产生。使用qRT-PCR证实外泌体中存在tsRNAs(图1i)，提示细胞可以将细胞tsRNAs组装进外泌体。

图1细胞培养基外泌体中tsRNA的表达谱

2肝癌患者差异表达的tsRNAs鉴定
   为了探索外泌体tsRNA在癌症诊断中的潜在价值，作者从肝癌患者和健康献血者的血浆外泌体中提取小RNA并进行测序。数据显示在血浆外泌体中miRNA是small RNA中种类最丰富的一种，而tsRNA占据了总small RNA的0.2-2%。此外，与健康供体相比，肝癌患者血浆外泌体中的tsRNA水平显著升高(图2a)；并且肝癌患者血浆外泌体中tRNA-5水平明显高于健康对照组(图2b)，提示肿瘤患者血浆外泌体中特异性tsRNA分泌异常。与细胞培养基的结果相似，tRNA-5s的长度大部分在31 - 34 nt之间，tRNA-3s主要为18 nt(图2c)。长度为30~33 nt的tRNA-5s水平在肝癌患者中显著升高，说明30~33 nt tRNA-5s可能是一种潜在的肿瘤诊断生物标志物。为了确定tsRNAs作为生物标志物的潜力，比较了血浆外泌体中tsRNA的水平，发现46个tsRNAs(35个上调，11个下调)在肝癌患者和健康供体之间存在差异表达(图2d)。

图2 来自血浆的外泌体中tsRNAs的分析

   此外，qRT-PCR结果显示，与健康供体相比，肝癌患者血浆外泌体中tRNA-ValTAC3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5、tRNA-GluCTC5水平明显升高(图3)，提示血浆外泌体tsRNA可以作为一种新的癌症诊断的生物标志物。


图3 肝癌患者和健康对照组血浆外体tsRNAs的验证
   在这项研究中，作者证明了来自细胞培养基和血浆的外泌体中存在丰富的tsRNA，代表外泌体中的一种新型小RNA。 此外，肝癌患者的血浆外泌体的tsRNA水平明显高于健康对照者。来自血浆外泌体的四种tsRNA在肝癌患者和健康供体之间差异表达，表明它们作为癌症诊断的新型“液体活检”生物标记物具有巨大潜力。 综上所述，此研究不仅扩大了外泌体中的非编码RNA种类，而且揭示了tsRNA作为有希望的癌症生物标志物的诊断价值。