慢病毒感染ADSC细胞
慢病毒感染RAW264.7细胞
目前生物医学研究中常用的病毒载体包括慢病毒，逆转录病毒，腺相关病毒，腺病毒。表1简单的总结了四种病毒载体的基本生物学特性。慢病毒感染范围广，表达稳定长效，已经成为分子生物操作中的常规载体，越来越多的分子生物学技术与方法借助于慢病毒载体得以应用。腺病毒载体作为研究和使用时间最长的载体，虽然存在一些不足，但其特点依然鲜明，即感染速度快，基因装载量大。逆转录载体因其特殊的感染特性，仍在干细胞和血液细胞等分裂细胞研究中占有一席之地。而势头强劲的腺相关病毒因其极高的滴度和低转基因安全性，成为基因治疗研究的新宠儿。
表1 不同病毒的生物学特性比较
|
|
慢病毒 |
逆转录病毒 |
腺相关病毒 |
腺病毒 |
| 包膜 |
有 |
有 |
无 |
有 |
| 颗粒直径 |
90-100 nm |
90-100 nm |
20-30 nm |
60-90nm |
| 基因组 |
dsRNA |
dsRNA |
ssDNA |
dsDNA |
| 表达起始时间 |
48-72h |
48-72h |
72-96h |
24-48h |
| 表达持续时间 |
> 2 months |
> 2 months |
> 6 months |
< 1 month |
| 整合方式 |
随机高频整合 |
随机高频整合 |
定向低频整合 |
非整合 |
rAAV感染小鼠大脑外侧缰核
rAAV整体注射感染肝脏
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 AAV的血清型是指目前已发现的不同衣壳蛋白的数十种AAV在体内产生不同的抗血清类型，它们对相同的组织和细胞具有不同的感染效率。
表2 不同血清型AAV的组织嗜亲性
| 血清型 |
适用组织 |
胞外吸附分子 |
| AAV1 |
肌肉,心脏,神经 |
未知 |
| AAV2 |
体外,神经 |
硫酸乙酰肝素蛋白多糖 |
| AAV5 |
肺,眼睛,神经 |
N-唾液酸 |
| AAV6 |
肺,心脏 |
未知 |
| AAV7 |
肌肉,肝脏 |
未知 |
| AAV8 |
肝脏,肌肉,眼睛 |
未知 |
| AAV9 |
肺,肝脏，肌肉，心脏 |
未知 |
| rh10 |
肋膜,神经 |
未知 |
腺相关病毒与其他几种常用病毒载体相比，具有感染温和，免疫原性小，长效稳定表达的特点。AAV的主要应用方向在于定位注射和整体注射实验。
重组腺相关病毒rAAV是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体，一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。
纽恩生物腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下rAAV的滴度在1012~1013v.g. /ml，完全可以满足不同实验的使用要求如针对一些特异细胞群体的感染和基因操作或直接进行整体和定位的体内注射实验。腺相关病毒载体构建与包装服务可选的载体信息如下：
腺相关病毒载体列表
| 载体名称 |
载体用途和容量 |
编号 |
| pAOV-CAG-MCS-3FLAG |
基因表达，容量2.2k |
AOV-001 |
| pAOV-CAG-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
AOV-002 |
| pAOV-CAG-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
AOV-003 |
| pAOV-CAG-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
AOV-004 |
| pAOV-CAG-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
AOV-005 |
| pAOV-CMV-MCS-3FLAG |
基因表达，容量2.3k |
AOV-021 |
| pAOV-CMV-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
AOV-022 |
| pAOV-CMV-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
AOV-023 |
| pAOV-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
AOV-024 |
| pAOV-CMV-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
AOV-025 |
| pAOV-CMV-bGlobin-MCS-3FLAG |
基因表达，容量1.9k |
AOV-031 |
| pAOV-CMV-bGlobin-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量1.2k |
AOV-032 |
| pAOV-CMV-bGlobin-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量1.2k |
AOV-033 |
| pAOV-CMV-bGlobin-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.2k |
AOV-034 |
| pAOV-CMV-bGlobin-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.2k |
AOV-035 |
| pAOV-EF1A-MCS-3FLAG |
基因表达，容量2.0k |
AOV-051 |
| pAOV-EF1A-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量1.3k |
AOV-052 |
| pAOV-EF1A-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量1.3k |
AOV-053 |
| pAOV-EF1A-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.3k |
AOV-054 |
| pAOV-EF1A-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.3k |
AOV-055 |
| pAOV-SYN-MCS-3FLAG |
基因表达，容量2.3k |
AOV-061 |
| pAOV-SYN-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
AOV-062 |
| pAOV-SYN-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
AOV-063 |
| pAOV-SYN-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
AOV-064 |
| pAOV-SYN-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
AOV-065 |
| pAKD-CMV-bGlobin-eGFP-H1-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
AKD001 |
| pAKD-EF1A-eGFP-H1-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
AKD002 |
腺相关病毒应用案例
慢病毒（Lentivirus）是一种逆转录病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并将外源基因整合至宿主基因组，实现长期的稳定表达（图1）。 慢病毒目前可以在细胞或者体内实现长效的外源基因表达和基因沉默。结合抗生素标记的使用，经过筛选的细胞可以作为阳性的多克隆株，也可以大大提高单克隆阳性株的表达效率和筛选效率。
除此之外，对于转染试剂难以转染的细胞，如原代细胞、干细胞和悬浮细胞等，使用慢病毒可显著改善感染效果，实现体内和体外的实验检测（图2）。对腺病毒感染产生较强免疫反应的细胞如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞，使用慢病毒和逆转录病毒可有效减少免疫反应。逆转录病毒特异性的感染分裂细胞，可以用于体内感染和示踪干细胞亚群。
逆转录病毒改造自鼠白血病病毒（MMLV)，是一种RNA病毒，可以利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定长时表达。逆转录病毒特异性地感染分裂细胞，对造血干细胞和神经干细胞在体外和体内感染具有良好的效果。纽恩生物经过长期的研发，掌握了逆转录病毒载体构建和包装中的关键技术。逆转录病毒载体技术服务主要面向从事干细胞和发育研究。
纽恩生物在国内率先采用DNA拷贝数检测作为慢病毒及逆转录的质控方法，避免了使用RNA进行滴度检测带来的病毒滴度虚高问题，同时使国内广大科研工作者的工作更具有权威性和可信性。
图1 慢病毒感染细胞系
图2 慢病毒感染难转染细胞
针对贴壁生长性能的肿瘤细胞系，成纤维细胞系以及内皮来源细胞系进行感染的实验需求。这几类细胞感染复数较低，易于传代，比较适合于进行稳转株的筛选。直接使用上清慢病毒，可以减少由病毒浓缩操作带来的时间和病毒颗粒损失，具有较高的性价比。其适用的载体列表如下：
适用易转细胞系的慢病毒和逆转录病毒载体列表
| 载体名称 |
载体用途和容量 |
编号 |
| pLOV-CMV-MCS-3FLAG |
基因表达，容量3.5k |
LOV-101 |
| pLOV-CMV-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量2.8k |
LOV-102 |
| pLOV-CMV-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量2.8k |
LOV-103 |
| pLOV-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量2.8k |
LOV-104 |
| pLOV-CMV-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量2.8k |
LOV-105 |
| pLOV-EF1a-PuroR-CMV-MCS-3FLAG |
基因表达，容量2.3k |
LOV-106 |
| pLOV-EF1a-PuroR-CMV-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
LOV-107 |
| pLOV-EF1a-PuroR-CMV-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量1.6k |
LOV-108 |
| pLOV-EF1a-PuroR-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
LOV-109 |
| pLOV-EF1a-PuroR-CMV-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量1.6k |
LOV-110 |
| pLKD-CMV-PuroR-U6-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
LKD001 |
| pLKD-CMV-NeoR-U6-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
LKD006 |
| pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
LKD007 |
针对悬浮细胞、原代细胞和干细胞等难感染细胞。表达载体的启动子推荐采用EF1a和UbiC。病毒的生产后通过进行浓缩减少感染操作中的病毒添加体积和血清中杂质带来的风险因素，是进行难操作细胞及定点注射进行体内感染的最佳选择。
难转染细胞可选慢病毒和逆转录病毒载体列表
| 载体名称 |
载体用途和容量 |
编号 |
| pLOV-EF1a-MCS-3FLAG |
基因表达，容量3.5k |
LOV-201 |
| pLOV-EF1a-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量2.8k |
LOV-202 |
| pLOV-EF1a-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量2.8k |
LOV-203 |
| pLOV-EF1a-EGFP-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量2.8k |
LOV-204 |
| pLOV-EF1a-mCherry-2A-MCS-3FLAG |
基因独立表达，容量2.8k |
LOV-205 |
| pLOV-UBC-MCS-3FlAG |
基因表达，容量3.5k |
LOV-206 |
| pLOV-UBC-EGFP-3FlAG |
基因表达，容量2.8k |
LOV-207 |
| pLKD-UbiC-GFP-U6-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
LKD008 |
| pROV-EF1a-EGFP-3FLAG |
逆转录基因表达，容量1.3k |
ROV001 |
| pROV-EF1a-MCS-3FLAG |
逆转录基因表达，容量2.0k |
ROV002 |
| pRKD-FE1A-eGFP-U6-shRNA |
shRNA及microRNA表达 |
RKD001 |
rAAV感染动物眼部视神经
腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。虽然一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、上呼吸道或眼部上皮细胞的急性感染；但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。腺病毒易于制备、纯化和浓缩，且病毒滴度可高达1012PFU/ml，所以，它介导的基因治疗常采用in vivo的方式进行，是目前基因治疗临床试验中应用较多的一种载体。
纽恩生物建立了一套成熟的腺病毒包装系统和工艺，以满足各类科研用户的不同需求。该系统是以复制缺陷型腺病毒DNA为骨架构建成的重组腺病毒系统，在穿梭载体、病毒骨架载体及包装细胞系等方面有很大优势：出毒稳定、滴度高、包装可靠。病毒滴度可以达到 1×1010 -12 pfu/ml，可以满足细胞水平研究所需病毒量和满足瘤内注射需要量不同规格病毒。
腺病毒载体列表
| 载体名称 |
载体用途和容量 |
编号 |
| pDOV-mCMV-MCS-3FLAG |
基因表达，容量4~5k |
DOV001 |
| pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG |
基因表达，容量3~4k |
DOV002 |
| pDOV-mCMV-MCS-mCherry-3FLAG |
基因表达，容量3~4k |
DOV003 |
| pDKD-CMV-U6-shRNA |
shRNA和microRNA表达 |
DKD001 |
目前随着基因功能学研究的深入，实验的设计和操作日趋严谨。一些机制在进行体内验证之前，都必须进行外源验证。如shRNA沉默效率，microRNA结合作用，Cre依赖的DNA重组等。纽恩生物采用在293T这种容易转染的细胞作为外源验证体系，通过共转染的方式（图1~3）快速地确认机制有效性，将研究者从繁冗的克隆构建工作中解放出来，专注于基因表型和功能研究。
图1 shRNA外源筛靶
图2 microRNA外源靶点结合验证
图3 Cre依赖的基因定位重组方法原理