一、细菌内毒素的研究

从发现内毒这种物质至今，人们对其的研究已有200多年历史。由于这种毒素的最主要表现就是引起发热，在19世纪，大多数人将其称为致热物质或致热原。在19世纪后期，霍乱流行， Robert Koch通过对霍乱的研究发现，霍乱弧菌能产生两种完全不同的毒素，这种毒素可牢固结合在细菌细胞上，具有很强的毒性作用，在细菌溶解时才被释放出来。与此同时，意大利人也从大肠杆菌，伤寒沙门菌等自溶物中分离出一种无菌白色粉末的高致热活性物质，且与细菌感染引起的病理变化密切相关，并将该物质命名为内毒素。 

随着内毒素分离方法不断改进和提高，以及相关科学，如化学、生物学、血清学的发展，20世纪50年代后，人们逐步认识到这些从革兰阴性菌分离得到的物质其实是同一种成分，并且是所有革兰阴性细菌细胞壁外膜上的主要结构成分，对细菌生长和活力至关重要，是革兰阴性细菌的主要致病因子，并且将这些物质统称为内毒素或脂多糖（LPS）。20世纪80年代后，细菌内毒素研究进入到细胞和分子水平，并逐步明确了内毒素的致病作用及其分子机制。从此内毒素的研究日益受到微生物学家、临床医师、生物学家和免疫学家的普遍重视。

细菌内毒素的有效活性成分为脂多糖（Lipopdysaccharide，LPS）。而脂多糖来自革兰阴性细菌细胞外膜，其被水解释放的O-抗原复合物（O-特异性多糖链、核心多糖和类脂A）。其生物活性或毒性反应主要表现为：

• n  致热性

• n  白细胞、血小板减少

• n  降低血压休克

• n  激活凝血系统（形成弥散性血管内凝血）

• n  诱导抗感染的非特异性抵抗力

• n  诱导炎症介质过度表达，释放多种细胞因子（肿瘤坏死因子TNF-a、白介素IL-1和IL-6、血小板活化因子PAF）

• n  对鲎血细胞溶解物凝集反应

二、细菌内毒素的检测研究

内毒素的检测研究首先起源于注射药品。由于伴随着注射剂引起的发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷甚至死亡等内毒素所致的不良反应，于是确定了药品注射剂热原检查是保证用药安全的重要检验项目。1968年，美国科学家Dr Levin和Bang成功提取鲎血细胞溶解物，提出了细菌内毒素的凝胶试验法。至1982年，美国开始将该法应用于药品内毒素检测，并快速推广普及。

我国在该方面的工作起步较慢，为了更好的组织科研力量，1983年，卫生部药政局给中国药品生物制品检定所下达了对部分注射药品热原检查法用鲎试验代替的研究任务。1988年以后，我国鲎试剂的研究已获得成功，初步建立了细菌内毒素检查法，并得到官方的认可。从此，对鲎试剂及内毒素检测技术的研究成为医药卫生领域专家学者争相研究的课题。从凝胶法（半定量）发展到了光度测定法（包括显色基质法和动态浊度法），可以实现微量内毒素的定量检测。

发展至今，细菌内毒素光度测定法，已被广泛用于注射药品、生物制品和医疗器械的细菌内毒素检测。基于内毒素是革兰阴性菌的主要致病因子，对机体的影响极其复杂，与人类健康和疾病密切相关。我国在90年代曾有报道，用鲎试剂对人体血液的内毒素检查，但由于鲎试剂凝胶法检查标准化程度低，无法定量，并受到血液样本中抗脂多糖因子的干扰。因此，鲎试剂凝胶法一直无法用于血液细菌内毒素的临床检测。 

1、     血液细菌内毒素检测技术要解决的问题

经相关学者研究发现，采用鲎试验法检测血液标本中的内毒素时存在两个难题。首先，血液中含有多种抑制和干扰内毒素检测的物质；并且，血液样本中的内毒素水平较低，常常位于鲎试验法的临界值；血浆中的多种成分，如胆盐、蛋白和脂蛋白等均可与内毒素相互作用，从而导致内毒素的解聚、活性抑制或与内毒素形成复合物；此外，可与内毒素结合的蛋白，如脂多糖结合蛋白和杀菌/通透性增强的蛋白，也会影响内毒素的检测结果。由于人体血液成分的干扰，一直以来，血液样本的内毒素提取纯化技术以及鲎试剂的特异性反应特性等问题未能解决。因此，国内外还无法开展血液细菌内毒素的临床检测。

为了使内毒素检查法应用到人体血液细菌内毒素的检测，辅助临床检查诊断“内毒素血症”和“不明发热”提供科学依据，本公司开展了“特异性定量鲎试剂研究”、“人体血液内毒素提取方法的研究”和“反应体系的研究”，并取得了突破性进展。

1>特异性定量鲎试剂的研究

本公司于1991年11月，研究成功 “鲎试剂活性定向生产工艺”，该成果通过广东省科委组织的科技成果鉴定，载入《中国科技成果大全》，并于1995年获国家知识产权局颁发的发明专利。在此原创技术的基础上，我公司开始了特异性定量鲎试剂的研究。从海洋生物东方鲎血液提取的C因子、B因子和凝固蛋白酶活性物质

研究成功特异性定量鲎试剂，并使该试剂对内毒素与葡聚糖的鉴别符合率达100%，线性检测范围达到0.005EU/ml-100EU/ml；相关系数r≥0.98，变异系数＜10%。

2>血液细菌内毒素的提取技术研究

①血液内毒素提取试剂应澄明、无菌无热原，将本品分别制成8倍稀释液后，吸取0.15ml与本项光度法试剂0.2ml相混合，移置BET检测系统观察4600秒，其浊度反应OD值应为0。

②具有血液抗凝活性，并在80-85℃加热20分钟，细菌内毒素不被破坏，使血液内毒素趋于分散和溶出的功能，通过外加内毒素标准溶液检测回收率应达到80-150%。

③血液提取物的8倍稀释液与内毒素浓度为0.25Eu/ml的标准溶液等体积混匀后，移置BET检测系统（37℃）观察3600秒，具有 S型反应曲线形成。

3>检测方法

  本项目参考《中华人民共和国药典》(2010年版二部)细菌内毒素光度测定法为依据，利用主剂凝固酶原被微量细菌内毒素激活产生浊度或凝集反应的机理，并以反应物内毒素浓度越高所需反应时间越短的相关性，通过细菌内毒素检测系统观察反应物的浊度（对光吸收率）变化，分别对反应时间和反应物（内毒素标准溶液）浓度取对数，用最小二乘法做线性回归（Lgt=a+blgc）得到反应曲线，计算出血液内毒素浓度。

（1）主要流程

（2）血液细菌内毒素提取流程

2、     可行性

1>内毒素检测的特异性

2>准确性

3>临床应用研究情况

在本次临床检测结果表明，100例确诊为发热病人血液样本的内毒素检测值大于参考值的有82例；120例健康或亚健康人体血液样本的内毒素检测值，与参考值进行比较，有98例检测值低于医学参考值。如下表所示：

（1）临床灵敏度

100例发热病人检测阳性82例，即阳性率为82%，产品临床灵敏度可初步定为82%，通过对住院发热患者血液样本的内毒素检测，完成了临床灵敏度评估。

临床灵敏度=×100%=×100%=82%

临床灵敏度为82%，即实际有病而按该诊断标准被正确地判为有病的百分率为82%。

（2）临床特异性

120例健康或亚健康人体血液样本的检测值，有98例为阴性，即阴性率为81.7%，故临床特异性为81.7%，由此完成了产品临床特异性评估

临床特异性=×100%=×100%=81.7%

临床特异性为81.7%，即实际无病按该诊断标准被正确地判为无病的百分率为81.7%。

（3）准确性分析

由于抗生素的使用，当前在医院临床病原学诊断“细菌培养”阳性率降低，给临床诊断带来困难。通过100例发热患者血液样本的内毒素检测，其阳性率为82%，同时进行了病原学“细菌培养”的试验，其中有11例血液样本培养出革兰阴性菌，而这11例革兰阴性菌感染的血液样本内毒素检测均为阳性。试验的结果，进一步说明了细菌内毒素是由革兰阴性菌产生的理论相符合。另外有1例革兰阳性菌和1例真菌感染的血液样本，内毒素检测均为阴性，又进一步说明了本试剂盒所具有的特异性。如下表所示：

从上表的临床试验结果分析，因临床治疗抗生素的使用，使细菌培养阳性率降低，不能完全确知血液样本感染的是何种菌株，而本试剂盒用于患者血液样本的细菌内毒素检测，可判定革兰阴性菌感染情况和治疗效果，并克服了“细菌培养”无法检测内毒素致热活性的难题。

4>注册情况

目前，利用本公司生产的动态浊度法反应主剂和体液处理剂所组成的试剂盒，已完成产品分析性能和临床分析性能评估，通过了国家规定的生产质量管理体系考核，经官方检验机构检验，符合产品质量标准。该技术成果是目前中国，乃至世界上，首个用于检测人体血液细菌内毒素致热活性物质的新型体外诊断试剂产品，是用于临床检查诊断内毒素血症和不明发热最有效、最科学的诊断技术。

编辑： gaowei2010    来源：丁香园