G3000SWXL色谱柱对蛋白表面导入的半抗原数量的定量分析
免疫染色和酶联免疫吸附测定(ELISA)法中，在蛋白表面上结合小分子（如染料或半抗原）是普遍采用的一种方法。在本数据中，使用分子尺寸排阻色谱法（SEC）并通过抗半抗原单克隆抗体（anti-DNP抗体，Fab）对蛋白（碱性磷酸酶：ALP）表面导入的半抗原（二硝基酚：DNP）的分布进行评价分析。
色谱方法
色谱柱 : TSKgel G3000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm) 
流动相 : 20mmol/L phosphate + 0.3mol/L NaCl (pH7.0)
流速 : 0.25mL/min
检测 : UV (280nm)
温度 : 25C
进样体积 : 20μL
样品浓度 : DNP-ALP; 0.67g/L, anti DNP Fab; 1g/L
液相色谱仪 : Agilent 1120 Compact LC (gradient auto
system)
程序 :
在碱性磷酸酶(ALP)溶液(5g/L)中，加入摩尔比分别为1, 2, 4 的DNP-X-NHS 酯(AnaSpec, Cat#81228)/DMF 后，在4 度下保持17 个小时。然后使用分子尺寸排阻色谱法(SEC)分离纯化DNP-ALP。使用木瓜蛋白酶酶切/消化抗DNP 鼠单抗(Cosmo Bio, Cat#LO-DNP-61)至Fab，并通过分子尺寸排阻色谱法(SEC)分离纯化。
将过量的抗DNP 的Fab 片段(anti-DNP Fab)加入DNP-ALP 后并进行分析。抗DNP 的Fab 片段(anti-DNP Fab；50kDa)将会结合到DNP-ALP(100kDa)的表面。DNP-ALP 的表征分子量大小增加程度将取决于DNP 的导入程度。利用这种方法，可以定量分析蛋白表面导入的半抗原的平均数量及其分布情况。
说明：
碱性磷酸酶(ALPase)的分子量为100kDa。根据产品供应商的出厂检验数据表，我们使用了1%(A280)相当于10这样的关系来评价DNP 的导入比例。比例的评估Fab 片段的分子量为50kDa。我们使用了1%(A280)相当于14 这样的关系来评价DNP 的导入比例。
