G3000SWXL色谱柱对抗体片段(Fab’)2的分析
抗体的F(ab’)2 片段化是一种提高抗体穿透性、减少对ELISA 的非特异性吸附以及获得其他多种目的而被广泛采用的方法。对于F(ab’)2 片段的制备，胃蛋白酶的使用非常普遍。但不同种类或亚种类的抗体，对胃蛋白酶的敏感程度是不同的。因此，在酶切/消化反应的初期，对反应条件(如pH 或反应时间等)进行优化是需要的。本数据中介绍了一款特别适合于蛋白分析的TSKgel G3000SWXL分子尺寸排阻色谱柱，对使用胃蛋白酶进行老鼠单克隆抗体lgG1 酶切/消化时，单抗随时间变化情况的分析应用。
色谱条件
色谱柱 : TSKgel G3000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm)
流动相 : 20mmol/L Phosphate + 0.3mol/L NaCl (pH7.0)
流速 : 1.0mL/min
检测 : UV (280nm)
温度 : 25C
进样体积 : 20μL
样品浓度 : 0.192g/L
液相色谱仪 : Agilent 1120 Compact LC (gradient auto system)
程序 :
胃蛋白酶酶切/消化反应是在0.1mol/L 的柠檬酸盐缓冲液(pH3.7) 中，37 度的温度下进行的。
在5g/L 的抗体溶液中，加入40 单位的胃蛋白酶(Sigma P7012,1g/L)/mg 并孵化。
当酶切/消化反应分别进行到2, 5, 10, 30 和60 分钟时，取40uL 的反应溶液并立刻加入10uL 的3mol/L 的Tris(羟甲基)-氨基甲烷以阻止酶切/消化反应继续进行。
上述50uL 停止反应的溶液中，加入990uL 的20mmol/L 磷酸缓冲液+0.3mol/L NaCl(pH7.0)稀释后，进样分析。
