G3000SWXL色谱柱对抗体片段Fab的分析
抗体的Fab 片段化是一种提高抗体穿透性、减少对ELISA 的非特异性吸附以及获得其他多种目的而被广泛采用的方法。对于Fab 片段的制备，木瓜蛋白酶的使用非常普遍。本数据中介绍了一款特别适合于蛋白分析的TSKgel G3000SWXL分子尺寸排阻色谱柱，对使用木瓜蛋白酶进行老鼠单克隆抗体lgG1 酶切/消化时，单抗随时间变化情况的分析应用。
色谱条件
色谱柱 : TSKgel G3000SWXL (7.8mmI.D. x 30cm)
流动相 : 20mmol/L Phosphate + 0.3mol/L NaCl (pH7.0)
流速 : 1.0mL/min
检测 : UV (280nm)
温度 : 25C
进样体积 : 20μL
样品浓度 : 0.22g/L
液相色谱仪 : Agilent 1120 Compact LC (gradient auto system)
程序 :
木瓜蛋白酶酶切/消化反应是在含有0.15mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、25mmol/L 巯基乙醇的10mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.3)中，37 度的温度下进行的。
在5g/L 的抗体溶液中加入10%(体积比)的木瓜蛋白酶(Sigma P4762,1g/L)并孵化。
当酶切/消化反应分别进行到2, 5, 10, 30 和60 分钟时，取48.5uL 的反应溶液并立刻加入1.5uL 的1mol/L 的碘乙酰胺以阻止酶切/消化反应继续进行。
上述50uL 停止反应的溶液中，加入950uL 的20mmol/L 磷酸缓冲液+0.3mol/L NaCl(pH7.0)稀释后，进样分析。
